Forniamo un passo-passo protocollo per la cellula intera registrazione patch clamp di calcio Release-Activated di calcio (CRAC) correnti in cellule mononucleate del sangue periferico derivati linfociti T umani.
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Articolo metodologico
Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nei linfociti T, l'esaurimento di Ca 2 + dal intracellulare Ca 2 + negozio porta all'attivazione di plasmalemmal Ca + 2 canali, chiamati Calcio Release-Activated di calcio (CRAC) canali. Canali CRAC un ruolo molto importante nella regolazione della proliferazione delle cellule T e l'espressione genica. Anormale funzione del canale CRAC nelle cellule T è stato collegato a gravi malattie autoimmuni immunodeficienza combinata e 1, 2. Studiare la funzione CRAC canale in cellule T possono scoprire nuovi meccanismi molecolari che regolano le normali risposte immunitarie e svelare le cause di malattie umane correlate. Le registrazioni elettrofisiologiche delle correnti di membrana forniscono la valutazione più accurata delle proprietà del canale funzionale e la loro regolamentazione. Valutazione elettrofisiologica CRAC correnti di canale in cellule Jurkat T, un essere umano linea di leucemia a cellule T, è stata eseguita più di 20 anni fa 3, tuttavia, le misurazioni CRAC corrente in normali cellule T umano rimane un compito impegnativo. Le difficoltà di registrazione dei canali CRAC correnti in normali cellule T sono aggravate dal fatto che i derivati dal sangue i linfociti T sono molto più piccoli nelle dimensioni di cellule Jurkat T e, di conseguenza, l'intero endogeno delle cellule correnti CRAC sono molto bassi in ampiezza. Qui, diamo uno step-by-step procedura che abitualmente utilizzano per registrare il Ca 2 + o Na + correnti attraverso canali CRAC a riposo cellule T isolate dal sangue periferico di donatori sani. Il metodo qui descritto è stato adottato dalle procedure utilizzate per la registrazione delle correnti CRAC in cellule Jurkat T e cellule T attivate umane 4-8.
Protocollo
1. Preparazione di riposo linfociti T umani
- Utilizzando Cocktail RosetteSep umani arricchimento cellule T e Medium Density RosetteSep, purificare le cellule T da campioni di sangue umano secondo le istruzioni del produttore. La popolazione cellulare risultante dovrebbe contenere 95% di cellule T CD3 + riposo. Noi purificare i linfociti T umani da campioni di sangue periferico raccolti da volontari sani in conformità al protocollo approvato dal Consiglio di UC Davis interno Review.
- Dopo l'isolamento, risospendere riposo le cellule T ad una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml nel terreno di coltura contenente RPMI-1640 medium con la glutamina e HEPES, integrati da siero di vitello fetale del 10%, 2% GlutaMAX-I, 1% RPMI 1640 vitamina soluzione, 1% RPMI 1640 aminoacidi soluzione, piruvato di sodio 1% e 0,03% β-mercaptoetanolo.
- Luogo sospensione di cellule in fiasche di coltura cellulare e di mantenere a 37 ° C in un incubatore umidificato al 5% di CO 2 fino a 24 ore prima dell'esperimento.
2. Preparazione della Camera di registrazione
- I seguenti sono necessari per preparare camere di registrazione: a) al silicio O-ring, b) rotondo, 25 mm coprioggetto pulito con etanolo al 70% e distillata H 2 O, c) miscelato Sylgard184, preparati secondo le istruzioni del produttore e d) due 60 x 15 mm Petri.
- Luogo ~ 0,5 mL di misto Sylgard184 in un 60x15 mm piastra di Petri.
- Immergere la parte inferiore della O-ring nel pinze Sylgard184 utilizzando.
- Rimuovere l'eccesso Sylgard184 dal bordo della O-ring mettendo l'O-ring su una superficie pulita, come un altro piatto di Petri.
- Posizionare l'anello sul coprioggetto e premere verso il basso.
- Curare la Sylgard184 dal riscaldamento delle camere a 85 ° C per 40-60 minuti o fino a quando il Sylgard184 è polimerizzato.
- Memorizzare le camere di registrazione in un contenitore privo di polvere.
3. Preparazione del Pipette Patch
- Il giorno dell'esperimento, tirare pipette con diametro punta ~ 2-micron utilizzando vetro capillari e un estrattore pipetta. Utilizziamo tubi in vetro borosilicato con filamento (OD: 1,5 mm e ID: 1,10 mm). Pipette conservare in un luogo privo di polvere.
- Cappotto puntali con Sylgard184 o HIPEC rivestimento protettivo Semiconductor R6101, secondo una procedura standard 9.
- Delicatamente fuoco lucidare le pipette prima dell'esperimento.
4. Patch Morsetto Preparazione installazione
- Configurare e salvare le macro per la formazione gigaseal nel software di controllo del vostro patch-clamp amplificatore. Usiamo un EPC-10 amplificatore supportata da Windows XP e software Pulse per l'acquisizione dei dati. Abbiamo impostato il "set-up", "a-cella", e "a cellula intera" macro secondo la EPC-10 manuale e utilizzarli per tutti gli esperimenti.
- Preparare le soluzioni di bagno e soluzioni pipetta elencati nella tabella 1 prima l'esperimento e conservarli a 4 ° C per un massimo di 1 settimana.
| Prodotti chimici | Soluzioni per vasca da bagno (mM) | Soluzioni pipetta (mM) | ||
| # 1 | # 2 | # 3 | ||
| CH 3 SO 3 Na | 130 | 110 | 125 | - |
| NaCl | 2 | 4 | 5 | - |
| Ca (OH) 2 | - | 20 | - | - |
| MgCl 2 | 3 | 1 | - | 5 |
| MgSO 4 | - | - | - | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 15 |
| HEDTA | - | 10 | - | |
| EDTA | - | - | 1 | - |
| Cs-aspartate | - | - | - | 125 |
| Bapta | - | - | - | 12 |
| Glucosio | 10 | 10 | 10 | - |
Tabella 1. Soluzioni per le registrazioni CARC intera-cella corrente.
Tutti i prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
- Determinare i potenziali di giunzione liquida (LJ) tra la soluzione di pipetta di patch e ogni soluzione da bagno 10. Salvare il valore LJ nel luogo appropriato utilizzando il software di acquisizione. Per esempio, nel programma Pulse inserire il valore LJ in controllo "LJ" nella finestra "amplificatore".
- Configurare e salvare i protocolli di stimolazione, come mostrato nella Figura 1, nell'apposito spazio del vostro software di acquisizione prima che gli esperimenti. Nel programma Pulse, abbiamo impostato il protocollo di acquisizione della "Generazione Pulse" finestra.
Figura 1. . Protocollo di stimolazione rampa di tensione da -120 a +100 mV di 50 ms di durata viene applicata ogni 0,2 - 2 s (5 - 0,5 Hz). Potenziale Holding (V h) tra le rampe è mantenuta a 30 mV.
5. Le cellule di montaggio sullo stage microscopio
- Cappotto le camere di registrazione con poli-L-lisina per ~ 20 minuti e lavare con H 2 O e poi con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) prima di placcatura le cellule.
- Piatto 500 microlitri di sospensione cellulare contenente 0,2-0,5 x10 6 celle nella camera e incubare per 20 minuti a 37 ° C.
- Fissare la camera di registrazione con le cellule attaccato in un supporto da camera. Noi usiamo una misura porta della camera, dove la base sostiene la parte inferiore del vetrino, mentre la parte superiore leggermente preme contro la parte superiore del coprioggetto.
- Posizionare il supporto da camera sul palco del microscopio invertito.
- Concentrarsi sulle cellule in luce trasmessa. Usiamo un obiettivo 40X immersione in olio.
- Posizionare la Ag / AgCl elettrodo di riferimento nella vasca.
- Allineare l', multibarrel gravità sistema guidato perfusione. La punta del tubo di flusso deve essere posizionato ad un angolo di 45 ° fino alla fine coprioggetto al campo di vista.
- Posizionare il tubo di aspirazione di fronte alla punta del tubo di afflusso.
- Profumato la camera con tampone fosfato salino (PBS) o HBSS per lavare via i media di coltura cellulare e le cellule debolmente collegate.
6. CRAC Canale Correnti di registrazione
- Trova una cella che è saldamente attaccato al vetrino. Noi di solito selezionare una media grandezza, cellule rotonde con una superficie esterna liscia.
- Profumato della camera di registrazione con Ca 2 +-free, 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione bagno # 1 (tabella 1) contenente 0,5-1 thapsigargin mM per 8-10 minuti per bloccare la pompa SERCA. Eseguiamo questa operazione per esaurire il negozio prima della formazione gigaseal.
- Utilizzando un microloader Eppendorf e un P-20 pipetta a spostamento, riempire la pipetta di patch con la soluzione di pipetta (Tabella 1) e inserire la pipetta di patch nel supporto pipetta sulla headstage amplificatore. Il Ca 2 + chelante Bapta è incluso nella soluzione pipetta ad esaurire passivamente il negozio e per ridurre Ca 2 +-dipendente inattivazione del canale CRAC.
- Applicare una piccola quantità di pressione positiva (~ 3 pollici di H 2 O) dentro la pipetta di patch prima di entrare nel bagno. Noi usiamo una misura della pressione di aspirazione dispositivo collegato ad aria compressa e le linee di vuoto per creare una pressione positiva o negativa all'interno di una pipetta di patch.
- Abbassare la pipetta di patch nel bagno sotto controllo visivo tramite il microscopio. Nella finestra "Oscilloscopio", dovreste vedere una corrente che fluisce attraverso la pipetta. Un passo simile cambiamento nella ampiezza della corrente deve essere indotto da un impulso di tensione piccola ampiezza (trigger) applicato dalla macro preimpostate. A questo punto, dovreste essere in grado di determinare il valore di resistenza pipetta. La resistenza delle nostre pipette è tipicamente 5-6 MW.
- Correggere il potenziale "offset" generato tra la pipetta e l'elettrodo di riferimento.
- Sotto controllo visivo tramite il microscopio, portare la punta della pipetta più vicino alla cella fino a toccare la membrana cellulare.
- Applicare una pressione negativa (20-40 cm di H 2 O) dentro la pipetta di patch.
- Monitorare la formazione gigaseal nella finestra "oscilloscopio". Vedrete l'ampiezza della corrente, indotta dagli impulsi di test, diminuisce e aumenta il valore della resistenza pipetta> 5 GΩ. Forme di solito gigaseal all'interno di un fesecondo w, ma potrebbero essere necessari 1-2 minuti per ottenere un gigaseal stabile.
- Compensare la capacità pipetta ("C-Fast").
- Rompere la membrana del cerotto da applicare un'ulteriore pressione negativa utilizzando una siringa da 20 cc.
- Impostare il potenziale tenendo a +30 mV. Un potenziale tenendo positivo aiuta a prevenire il calcio-dipendente inattivazione del canale CRAC.
- Compensare la capacità della membrana della cellula ("C-slow"); salvare o registrare il valore di C-slow.
- Controllare il valore della resistenza di accesso "R s". Nei nostri esperimenti, la R s è tipicamente 7-20 MW.
- Iniziare ad applicare una serie di rampe di tensione con una frequenza di 0,5 Hz (Figura 1) a Ca 2 +-gratis 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione da bagno # 1. In questa soluzione, la corrente CRAC è trascurabile rispetto alla "fuga" in corso a causa della scarsa permeabilità dei canali CRAC per Mg 2 +. Salvare e utilizzare le tracce registrate in soluzione attuale vasca n. 1 su future analisi come "perdita" delle correnti. L'ampiezza assoluta della "fuga" in corso a -100 mV deve essere inferiore o uguale a 5 pA. Se la cella è "permeabile", interrompere l'esperimento e ricominciare con una pipetta nuova patch e una nuova cellula.
- Per registrare Ca 2 + corrente attraverso canali CRAC (I Ca-CRAC), sostituire Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione bagno # 1 con 20 mM di Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 (tabella 1) cambiando le valvole di perfusione. Questo permette di Ca 2 + a fluire attraverso canali CRAC e producono una corrente verso l'interno. Nella finestra "Oscilloscopio", si vedrà lo sviluppo di dentro rettificare I Ca-CRAC (Figura 2). L'ampiezza della corrente a tensioni negative continueranno ad aumentare per circa 1 minuto a causa del Ca 2 +-dipendente potenziamento della corrente CRAC.
- Aumentare la frequenza di stimolazione con rampe di tensione a 5 Hz, che è necessario per registrare il transitorio di corrente Na + attraverso canali CRAC.
- Sostituire il 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 con Na +-contenenti cationi bivalenti senza soluzione di # 3 (Tabella 1) cambiando le valvole di perfusione. Nella finestra "Oscilloscopio", si vedrà uno sviluppo di maggiore ampiezza transitoria interiormente rettificazione Na + corrente attraverso i canali CRAC (I Na-CRAC; Figura 2).
- Si può applicare 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2, che contengono 1-5 mM La 3 +, alla fine dell'esperimento per registrare la "fuga" di corrente. Tuttavia, non abbiamo trovato questo approccio utile perché la "perdita" cambiamenti in corso nel tempo e può diventare grandi o più piccoli alla fine dell'esperimento. Noi preferiamo seguire la corrente registrato nel Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione bagno # 1 all'inizio dell'esperimento come una "fuga" di corrente.
- Salva le tracce registrate in corso per ulteriori analisi.
7. Analisi dei dati
- Recuperare il record salvati corrente in software di analisi. Usiamo il programma di impulsi per l'analisi.
- Misurare le ampiezze corrente all'inizio e alla fine della rampa di tensione. Noi di solito misura le ampiezze di corrente a -100 mV e +100 mV con le coppie di cursori nella finestra "Oscilloscopio" del programma Pulse.
- Esportare i valori di ampiezze di corrente in un programma di grafica per ulteriori analisi e presentazione grafica. Noi usiamo grafica scientifica Origin e software per l'analisi, la versione 7.
8. Rappresentante Risultati
Figura 2. CRAC correnti in una cella di riposo T umani. (A), corso Tempo di correnti CRAC registrati in whole-cell voltage-clamp configurazione a -100 mV (cerchi pieni) e +100 mV (cerchi aperti). Prima di formazione gigaseal, la cella era preincubate per circa 10 minuti a Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione bagno # 1 thapsigargin contenenti 0,5 micron. Dopo il rodaggio, soluzioni bagno sono stati applicati in sequenza i seguenti: Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 +, che contiene la soluzione bagno # 1 (0 Ca + 3 Mg), seguiti da 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 (20 Ca), seguita da cationi bivalenti soluzione senza bagno # 3 (DVF), seguita dalla soluzione del bagno # 2 (20 Ca). La cella è stata stimolata da una serie di rampe di tensione, come mostrato nella Figura 1. La frequenza delle rampe è stato di 5 Hz in soluzione bagno # 3 (DVF) e 0,5 Hz in tutte le altre soluzioni. Si noti il lento sviluppo di I Ca-CRAC dopo l'applicazione di 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 e il rapido sviluppo transitoria di I Na-CRAC in soluzione bagno DVF # 3. (B), Rappresentante tracce registrate durante le rampe di attuale tensione a Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 +, che contiene la soluzione bagno # 1 ("Fuga"), 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 (20 Ca), e la soluzione del bagno # 3 (DVF). (C, D), corrente-tensione I rapporti di Ca-CRAC (C) e io Na-CRAC (D) ottenuto sottraendo "fuga" di corrente dalle correnti registrati durante tensione rampe in 20 mM Ca 2 + contenenti bagno soluzione # 2 (20 Ca), e la soluzione del bagno # 3 (DVF) mostrato nel grafico (B).
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Discussione
Le indagini elettrofisiologiche delle correnti CRAC a riposo cellule T è un compito impegnativo perché la endogeno ampiezza CRAC corrente in queste cellule è di piccole dimensioni a causa delle dimensioni piccole cellule (il riposo umano diametro delle cellule T è nel range di 5-8 micron). Qui vi presentiamo uno step-by-step procedura affidabile per registrare le correnti CRAC a riposo linfociti T umane isolate da cellule mononucleari del sangue periferico. Questa tecnologia ci permette di studiare la fisiologia e l'...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo grati al Dipartimento di Fisiologia e membrana Biologia, Università di California Davis per averci fornito servizi e un ambiente eccellente per lo studio dei canali ionici.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cocktail di arricchimento per linfociti T umani RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| Mezzo di densità RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| Mezzo RPMI 1640 con glutammina/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Serum fetale di vitello | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (soluzione 100X) | Invitrogen | 35050 | |
| Soluzione vitaminica RPMI 1640 (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| Soluzione di aminoacidi 1640 (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–etanolo | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Trifosfato di inositolo | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Cloridrato di poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Cloruro di lantanio | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargina | Calbiochem | 586005 | |
| Kit di elastomero siliconico Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Rivestimento protettivo per semiconduttori HIPEC R6101 | Dow Corning | ||
| Tavolo da laboratorio 63-500 Series ad alta prestazione per isolamento dalle vibrazioni | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| Amplificatore per patch clamp EPC 10 con testa | HEKA Instruments | ||
| Micromanipolatore | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Microscopio invertito Olympus 1X71 con obiettivo a immersione in olio 40x | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Computer Windows | Dell | ||
| Software Pulse | HEKA Instruments | ||
| Software di analisi e grafica scientifica Origin | OriginLab | ||
| Tiratore di pipette per patch | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Vetro borosilicato con filamento (diametro esterno: 1,5 mm e diametro interno: 1,10 mm) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Microfornace Narashige’s | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Anelli O in silicone | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslip da 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Riferimenti
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
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Ristampe e permessi
