Forniamo un passo-passo protocollo per la cellula intera registrazione patch clamp di calcio Release-Activated di calcio (CRAC) correnti in cellule mononucleate del sangue periferico derivati linfociti T umani.
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Articolo metodologico
Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nei linfociti T, l'esaurimento di Ca 2 + dal intracellulare Ca 2 + negozio porta all'attivazione di plasmalemmal Ca + 2 canali, chiamati Calcio Release-Activated di calcio (CRAC) canali. Canali CRAC un ruolo molto importante nella regolazione della proliferazione delle cellule T e l'espressione genica. Anormale funzione del canale CRAC nelle cellule T è stato collegato a gravi malattie autoimmuni immunodeficienza combinata e 1, 2. Studiare la funzione CRAC canale in cellule T possono scoprire nuovi meccanismi molecolari che regolano le normali risposte immunitarie e svelare le cause di malattie umane correlate. Le registrazioni elettrofisiologiche delle correnti di membrana forniscono la valutazione più accurata delle proprietà del canale funzionale e la loro regolamentazione. Valutazione elettrofisiologica CRAC correnti di canale in cellule Jurkat T, un essere umano linea di leucemia a cellule T, è stata eseguita più di 20 anni fa 3, tuttavia, le misurazioni CRAC corrente in normali cellule T umano rimane un compito impegnativo. Le difficoltà di registrazione dei canali CRAC correnti in normali cellule T sono aggravate dal fatto che i derivati dal sangue i linfociti T sono molto più piccoli nelle dimensioni di cellule Jurkat T e, di conseguenza, l'intero endogeno delle cellule correnti CRAC sono molto bassi in ampiezza. Qui, diamo uno step-by-step procedura che abitualmente utilizzano per registrare il Ca 2 + o Na + correnti attraverso canali CRAC a riposo cellule T isolate dal sangue periferico di donatori sani. Il metodo qui descritto è stato adottato dalle procedure utilizzate per la registrazione delle correnti CRAC in cellule Jurkat T e cellule T attivate umane 4-8.
Protocollo
1. Preparazione di riposo linfociti T umani
- Utilizzando Cocktail RosetteSep umani arricchimento cellule T e Medium Density RosetteSep, purificare le cellule T da campioni di sangue umano secondo le istruzioni del produttore. La popolazione cellulare risultante dovrebbe contenere 95% di cellule T CD3 + riposo. Noi purificare i linfociti T umani da campioni di sangue periferico raccolti da volontari sani in conformità al protocollo approvato dal Consiglio di UC Davis interno Review.
- Dopo l'isolamento, risospendere riposo le cellule T ad una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml nel terreno di coltura contenente RPMI-1640 medium c....
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Discussione
Le indagini elettrofisiologiche delle correnti CRAC a riposo cellule T è un compito impegnativo perché la endogeno ampiezza CRAC corrente in queste cellule è di piccole dimensioni a causa delle dimensioni piccole cellule (il riposo umano diametro delle cellule T è nel range di 5-8 micron). Qui vi presentiamo uno step-by-step procedura affidabile per registrare le correnti CRAC a riposo linfociti T umane isolate da cellule mononucleari del sangue periferico. Questa tecnologia ci permette di studiare la fisiologia e l'.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo grati al Dipartimento di Fisiologia e membrana Biologia, Università di California Davis per averci fornito servizi e un ambiente eccellente per lo studio dei canali ionici.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cocktail di arricchimento per linfociti T umani RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| Mezzo di densità RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| Mezzo RPMI 1640 con glutammina/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Serum fetale di vitello | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (soluzione 100X) | Invitrogen | 35050 | |
| Soluzione vitaminica RPMI 1640 (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| Soluzione di aminoacidi 1640 (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Piruvato di sodio | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–etanolo | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Trifosfato di inositolo | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Cloridrato di poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Cloruro di lantanio | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Thapsigargina | Calbiochem | 586005 | |
| Kit di elastomero siliconico Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Rivestimento protettivo per semiconduttori HIPEC R6101 | Dow Corning | ||
| Tavolo da laboratorio 63-500 Series ad alta prestazione per isolamento dalle vibrazioni | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| Amplificatore per patch clamp EPC 10 con testa | HEKA Instruments | ||
| Micromanipolatore | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Microscopio invertito Olympus 1X71 con obiettivo a immersione in olio 40x | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Computer Windows | Dell | ||
| Software Pulse | HEKA Instruments | ||
| Software di analisi e grafica scientifica Origin | OriginLab | ||
| Tiratore di pipette per patch | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Vetro borosilicato con filamento (diametro esterno: 1,5 mm e diametro interno: 1,10 mm) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Microfornace Narashige’s | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Anelli O in silicone | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Coverslip da 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Riferimenti
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
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Ristampe e permessi
