L'articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per le analisi di citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll
In questo articolo
Sommario
Abstract
Isolamento di cellule immunitarie che si infiltrano nel sistema nervoso centrale (SNC) durante l'infezione, traumi, malattie autoimmuni o neurodegenerazione, è spesso necessaria per definire la loro fenotipo e funzioni effettrici. Approcci istochimiche sono strumentali per determinare la posizione delle celle di infiltrarsi e di analizzare il sistema nervoso centrale associata patologia. Tuttavia, in situ e tecniche di colorazione istochimica immunofluorescenza sono limitati dal numero di anticorpi che possono essere usati in una sola volta a caratterizzare sottotipi di cellule immunitarie in un particolare tessuto. Pertanto, gli approcci istologici in collaborazione con immuno-fenotipo mediante citometria di flusso sono fondamentali per caratterizzare completamente la composizione del locale infiltrazione sistema nervoso centrale. Questo protocollo si basa sulla separazione del sistema nervoso centrale sospensioni cellulari più discontinue gradienti di Percoll. L'articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per l'identificazione delle varie popolazioni di cellule immunitarie in un singolo campione mediante citometria di flusso.
Protocollo
Preparazione dei reagenti
Preparare magazzino isotonica Percoll (SIP), 4 ml al cervello, mescolando 9 parti di Percoll con una parte di HBSS 10X senza Ca + + e Mg + +.
Preparare SIP al 70% in 1X HBSS senza Ca + + e Mg + +, 2 ml al cervello dispensato in un tubo da 15 ml in polipropilene.
Nota: Si raccomanda di Percoll dovrebbe essere usato a temperatura ambiente, se usato a freddo, le cellule tendono a raggrupparsi e la separazione delle cellule è meno efficiente.
Tessuto di raccolta e omogeneizzazione
Anestetizzare topi e profu....
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Discussione
Le analisi di marcatori cellulari di superficie nei leucociti sistema nervoso centrale dai tessuti del mouse normale e infiammata è stata utilizzata per decenni 1-3. Protocolli di isolamento si basano nella separazione della microglia e leucociti da 4 densità centrifugazione. Qui si descrive un metodo veloce ed efficace di isolare leucociti sistema nervoso centrale mediante gradienti di Percoll discontinuo. Dopo l'isolamento delle cellule, colorazione con anticorpi diversi come ad esempio-ma no.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Nazionale Sclerosi Multipla (TA 3021-A1 / T per AEC) e l'Università del Texas a San Antonio.
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Materiali
Omogeneizzazione dei tessuti e gradienti
- Percoll (Amersham)
- Sale 10X Hanks 'soluzione equilibrata, senza calcio e magnesio (Gibco)
- RPMI Media 1640, senza rosso fenolo (Gibco)
- 7-ml o 15 ml Dounce Tissue Smerigliatrici (VWR)
Citometria a flusso
- Buffer di colorazione delle cellule (Biolegend)
- Rat purificato CD16/CD32 anti-topo (mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Emocitometro (Fisher)
- Anti-topo CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- Soluzione salina tamponata con fosfato 10X, senza calcio e magnesio (Thermo Scientific)
- Paraformaldeide (Sigma Aldrich)
- Analisi di citometria a flusso eseguita con un II LSR (BD Biosciences)
Riferimenti
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
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Ristampe e permessi
