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Preparazione dei reagenti
Preparare magazzino isotonica Percoll (SIP), 4 ml al cervello, mescolando 9 parti di Percoll con una parte di HBSS 10X senza Ca + + e Mg + +.
Preparare SIP al 70% in 1X HBSS senza Ca + + e Mg + +, 2 ml al cervello dispensato in un tubo da 15 ml in polipropilene.
Nota: Si raccomanda di Percoll dovrebbe essere usato a temperatura ambiente, se usato a freddo, le cellule tendono a raggrupparsi e la separazione delle cellule è meno efficiente.
Tessuto di raccolta e omogeneizzazione
Anestetizzare topi e profumato attraverso il ventricolo sinistro con HBSS 1X ghiacciata. Sezionare il cervello e il midollo spinale e mantenere in RPMI senza rosso fenolo fino a quando tutti i topi vengono sacrificati.
Tessuti posto in 7 o 15 ml dounce omogeneizzatore contenente 3 ml di RPMI, gentilmente fare una sospensione cellulare con una linea morbida pestello (Una dimensione) seguito da un Tigh-montaggio pestello (dimensione B) per dissociare ulteriormente i tessuti. Completa il volume della sospensione cellulare a 7 ml con RPMI.
Gradiente impostato
Aggiungere 3 ml di SIP alla sospensione cellulare per fare un SIP finale del 30%
Lentamente lo strato di sospensione cellulare 10 ml sulla parte superiore della SIP 70%. Questa è la fase più critica della procedura, utilizzare una pipetta-aiuto al modo di gravità evitando la miscelazione del 70% e il 30% delle soluzioni. Una linea molto chiara piatto dovrebbe essere visibile al 70% -30% di giunzione.
Centrifugare 30 min a 500G 18 ° C. Assicurarsi centrifuga si ferma con freno minimo o nessun modo che l'interfase non è disturbato.
Utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere delicatamente lo strato di detriti dalla parte superiore del tubo e raccogliere 2,0-3,0 ml di 70% -30% interfase in una provetta pulita conica contenente 8 ml di 1X HBSS. Assicurarsi che il Percoll contenente l'interfase viene diluita a circa tre volte, mescolare un paio di volte per inversione e centrifugre 7 min a 500G a 18 ° C.
Risospendere il pellet in 1 ml di buffer di colorazione della cellula e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml e lavare ancora una volta utilizzando un micro-centrifuga a 10.000 G 1 min a 4 ° C.
Anticorpi colorazione
Pellet Risospendere in 50 ml di purificato antimouse CD16/CD32 diluito 1:200 in tampone di colorazione delle cellule per bloccare i siti di legame Fc. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
Aggiungere 50 ml di miscela di anticorpi cocktail e incubare in ghiaccio per 30 min. Ogni anticorpo deve essere il primo titolato a valutare la diluizione ottimale. Uso appropriato combinazioni fluorocromo scelti in base alla capacità di laser e impostazioni del filtro del citofluorimetro particolare.
Lavare le cellule in tampone di colorazione della cellula, pellets risospendere in 100-200 ml di buffer di colorazione della cellula e di analizzare immediatamente nel citometro, o in alternativa le cellule possono essere risospese in 2% paraformaldeide (PFA), preparati in PBS e conservato durante la notte a 4 ° C .
Rappresentante dei risultati:
Dopo avere girato le pendenze, il 70% -30% interfase dovrebbe avere definito un alone bianco, e la quantificazione delle cellule recuperate da un mouse ingenuo deve cedere 3-5 x10 5 celle per il mouse (cervello più midollo spinale). Cervello infiammato potrebbe avere i numeri che variano a seconda delle cellule infiammatorie del sistema nervoso centrale insulto o modello di malattia (Figura 1).
Figura 1. Isolamento di cellule mononucleate, da ingenuo e EAE-cervello a malattia di picco. Le cellule cerebrali sono stati separati sospensioni più discontinuo del 70% / pendenze Percoll 30%. Macchiato le cellule sono state incubate con Fc-block seguiti da anticorpi anti-CD45 per 30 minuti sul ghiaccio. Le cellule sono state lavate in tampone di colorazione della cellula, e fissato nel 2% PFA prima acquisizione in un LSR-II. CD45 intensità è misurata in asse Y, dove tre popolazioni distinte sono visualizzati. Un'ulteriore caratterizzazione del fenotipo CD45 delle cellule immunitarie di alta infiltrazione è implementata utilizzando anticorpi aggiuntivi e successivamente analizzati mediante citometria di flusso.