Articolo metodologico

Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

DOI:

10.3791/2367

⸱

26 gennaio 2011

 , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo fornisce una descrizione del modo di sezionare e registrare dalla preparazione della retina isolata nel topo. In particolare, viene descritto come registrare le risposte luce da una popolazione di cellule gangliari fluorescente e successivamente identificare e analizzare la sua morfologia.

Abstract

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I primi passi nella visione di vertebrati hanno luogo quando la luce stimola i coni e bastoncelli della retina 1. Queste informazioni vengono quindi segregati in quello che sono conosciuti come i percorsi di ON e OFF. Il segnale di fotorecettori informazioni luce alle cellule bipolari (BCS), che depolarizza in risposta ad un aumento (On ​​jacket) o diminuisce (Off jacket) di intensità luminosa. Questa separazione di informazioni luce viene mantenuta al livello delle cellule gangliari della retina (RGCs), che hanno dendriti stratificando sia nel sublamina Off dello strato interno plessiformi (IPL), dove ricevono input eccitatorio diretto da Off jacket, o stratificazione in il sublamina Uno degli IPL, dove ricevono input eccitatorio diretto da On jacket. Questa separazione di informazioni riguardanti aumenti o diminuzioni di illuminazione (On e Off percorsi) è conservato e segnalato al cervello in parallelo.

Il RGCs sono le cellule di uscita della retina, e sono quindi una cellula importante studiare per capire come le informazioni luce viene segnalata a nuclei visiva nel cervello. I progressi della genetica dei topi negli ultimi decenni hanno portato ad una serie di linee fluorescenti topo giornalista dove vengono etichettati specifiche popolazioni di RGC con una proteina fluorescente per permettere l'identificazione dei sottotipi RGC 2 3 4 e specifici mirati per la registrazione elettrofisiologiche. Qui, vi presentiamo un metodo per registrare le risposte luce da cellule gangliari fluorescente in un intatto, preparazione isolato della retina. Questa preparazione isolato retina permette di registrazioni dal RGCs dove il pergolato dendritiche è intatto e gli ingressi in tutto il pergolato intero dendritiche RGC sono conservati. Questo metodo è applicabile su una varietà di sottotipi di cellule gangliari ed è suscettibile di una vasta gamma di tecniche fisiologiche cella singola.

Protocollo

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Animale Uso Dichiarazione: Gli animali sono stati curati in conformità con le linee guida descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, utilizzando i protocolli approvati dalla University of Animal Care Minnesota e del Comitato Istituzionale Usa.

1) Preparazione delle soluzioni

  1. Prima di eseguire la registrazione elettrofisiologica, soluzioni intracellulari, extracellulari, enzimi e devono essere preparati.
  2. Extracellulare soluzione: mescolare una bottiglia (8.8g) di media in polvere Ames '(Sigma) con 1 l di H 2 O e 1,9 g di bicarbonato di sodio (23 mm)....

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Discussione

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Questa tecnica è applicabile a qualsiasi registrazioni delle cellule gangliari della retina da una retina isolata. Anche se in linea di mouse usato soprattutto intrinsecamente fotosensibili, melanopsina che esprimono RGCs sono etichettati con EGFP 2, 5, questo protocollo è facilmente trasferibile anche ad altre linee fluorescente RGC o può essere generalizzata a registrare da RGCs selezionati casualmente pure. Questa tecnica è particolarmente prezioso perché il pergolato dendritiche di ogni RGC e dei suoi neu.......

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Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Ringraziamo Darwin Hang per la sua assistenza tecnica.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Mezzo di Ames’Sigma-AldrichA1420
CollagenasiWorthington BiochemicalLS005273
IaluronidasiWorthington BiochemicalLS002592
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761
AlexaFluor 594 IdrazideInvitrogenA10442
NeurobiotinaVector LaboratoriesSP1120
ElectrodiSutter Instrument Co.BF120-69-10
PinzetteFine Science Tools11252-30
Forbici oftalmologicheFine Science Tools15000-00
Streptavidina 594InvitrogenS32356
VectashieldVector LaboratoriesH-1000
Serum di capraJackson ImmunoResearch005-000-001
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
ParaformaldeideElectron Microscopy Sciences19210

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).
  2. Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol<....

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Registrazione della risposta alla lucepreparazione della retina isolatapatch clamp whole cellmarcatura con traccianti fluorescentirimozione enzimatica del vitreotopi reporter geneticiregistrazione elettrofisiologicaanalisi della morfologia dendriticarisposta alla stimolazione luminosa

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