Qui si descrive una strategia efficace per rimuovere la seta ghiandole che producono con l'addome della femmina ragni vedova nera. Questa procedura permette l'isolamento rapido della seta producono sette distinte ghiandole in un modo altamente purificato, un importante processo di ricercatori che studiano la produzione della seta di ragno e l'assemblaggio delle fibre.
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Articolo metodologico
Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ragni moderni rotazione ad alte prestazioni fibre di seta con una vasta gamma di funzioni biologiche, compresa la cattura delle prede locomozione, lo sviluppo e la protezione di 1,2 figli. Ragni eseguire queste operazioni da diversi tipi di filatura di fibre distinte che hanno diverse proprietà meccaniche. Specializzazione di tale tipi di fibre si è verificato attraverso l'evoluzione delle diverse ghiandole che producono la seta, che funzionano come biofabbriche di piccole dimensioni. Queste produzione biofabbriche e archiviare grandi quantità di proteine della seta alla produzione di fibre. Attraverso una complessa serie di eventi biochimici, queste proteine della seta vengono convertite da un liquido in un materiale solido su di estrusione.
Gli studi hanno dimostrato che la meccanica seta di ragno sono più forti di acciaio ad alta resistenza 3. Le analisi per comprendere la relazione tra la struttura e la funzione di fili di seta di ragno hanno rivelato che la seta di ragno è costituito in gran parte delle proteine, o fibroins, che hanno ripete blocco all'interno del loro sequenze di proteine 4. Comune firme molecolari che contribuiscono alla resistenza alla trazione incredibile e l'estensibilità di seta di ragno vengono svelati attraverso l'analisi di cDNA seta tradotte. Date le straordinarie proprietà del materiale di ragno sete, laboratori di ricerca in tutto il mondo fanno a gara per capire e simulare il processo di filatura per la produzione di fibre di seta sintetica per applicazioni commerciali, industriali e militari. Una delle sfide principali di filatura della seta artificiale ragno in laboratorio di ricerca comporta una completa comprensione dei processi biochimici che si verificano durante l'estrusione di fibre della seta ghiandole che producono.
Qui vi presentiamo un metodo per l'isolamento di sette diverse ghiandole che producono la seta dal ragno cobweaving vedova nera, che include le ghiandole ampullate maggiori e minori [produce seta dragline e ponteggi] 5,6, tubuliform [seta uovo sintetizza caso] 7 , 8, flagelliform [funzione sconosciuta in pannocchia-tessitori], aggregato [rende seta colla], aciniforme [preda sintetizza il confezionamento e le discussioni caso uovo] 9 e piriforme [attaccamento produce seta disco] 10. Questo approccio si basa su anestetizzare il ragno con il gas di anidride carbonica, successiva separazione del cefalotorace con l'addome, e microdissezione del ventre per ottenere le ghiandole che producono la seta. Dopo la separazione dei diversi seta ghiandole che producono, questi tessuti possono essere utilizzati per recuperare le macromolecole diverse per distinte analisi biochimiche, tra cui quantitativa real-time PCR, nel nord-ovest e assorbente, la spettrometria di massa (MS o MS / MS), analisi per identificare nuove sequenze di proteine della seta, ricerca per le proteine che partecipano al percorso di assemblaggio di seta, o utilizzare il tessuto intatto per colture cellulari o esperimenti istologici.
Protocollo
1. Anestetizzare il ragno e l'isolamento del ventre
- Trasferire il ragno da un vaso di vetro in una scatola di cartone foderato con plastica (Figura 1A). Noi di solito raccolgono ragni da cataste di legna, garage o cespugli e ospitarli in laboratorio in contenitori di vetro. Perché il ragno non può salire il rivestimento in plastica, fornisce un metodo efficiente per trasferire il ragno da un vaso di vetro o di latta di caffè in una piccola fiala per scopi anestetizzante. Durante la manipolazione del ragno, a questo punto, si dovrebbe indossare due paia di guanti in lattice o guanti da giardinaggio per motivi di sicurezza.
- Mentre il ragno è in cas....
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Discussione
La nostra metodologia per la microdissezione della seta ghiandole che producono dalla vedova nera offre un mezzo efficace per ottenere altamente purificato seta ghiandole che producono. Dissezioni può essere completato in 1,5 a 3 ore, producendo un set completo di sette distinte seta ghiandole che producono da cobweavers. Ottenere altamente purificato seta ghiandola campioni consente agli investigatori la possibilità di eseguire una vasta gamma di studi biochimici, inclusa l'identificazione di seta o di nuove protei.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una RUI NSF Concessione MCB-0950372 dal titolo Caratterizzazione molecolare di Sete Ragno Nero Widow.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 0,1 M in acqua |
| Pirocarbonato di dietile | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0,1% v/v |
| Citrato di sodio | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 0,015 M in acqua |
| Microscopio stereoscopico | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Telecamera digitale per microscopio | Leica Microsystems | DFC320 | Software - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Forbici di Vannas | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| Pinzette in acciaio inossidabile | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Spilli per insetti | Indigo Instruments | 33414-2 | Spilli per insetti #2 |
| Piatti di dissezione piccoli o grandi | Living Systems Instrumentation | DD-50-S o DD-90-S | 52 mm di diametro x 18 mm H (profondità Sylgard ~6 mm) o 93 mm x 22 mm |
| Drosophila provette per colture | Carolina Biological | FR-17-3076 | Dimensione: 31,75 mm di diametro x 101,6 mm |
Riferimenti
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys....
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Ristampe e permessi
