Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

Sommario

Qui si descrive un metodo che utilizza la potenza di microiniezione accoppiato con fluorescente In situ al fine di misurare con precisione la cinetica esportazione nucleare di mRNA nelle cellule somatiche dei mammiferi.

Abstract

Negli eucarioti, RNA messaggero (mRNA) è trascritto nel nucleo e devono essere esportati nel citoplasma per accedere al macchinario di traduzione. Anche se l'esportazione nucleare di mRNA è stata ampiamente studiata in ovociti di Xenopus ¹ e gli organismi geneticamente docile come lievito ² e la linea cellulare derivata Drosophila S2 ^3, pochi studi erano stati condotti in cellule di mammifero. Inoltre, la cinetica di esportazione mRNA in cellule somatiche dei mammiferi poteva solo essere dedotta indirettamente ^4,5. Per misurare la cinetica esportazione nucleare di mRNA nelle cellule di mammifero coltura tissutale, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza la potenza di microiniezione accoppiata con ibridazione in situ fluorescente (FISH). Questi test sono stati utilizzati per dimostrare che in cellule di mammifero, la maggior parte degli mRNA vengono esportati in modo splicing dipendente ^6,7, o in modo che richiede specifiche sequenze di RNA come la regione sequenza segnale di codifica (SSCR) ^6. In questo saggio, le cellule sono microiniettati sia con mRNA sintetizzato in vitro o DNA plasmide contenente il gene di interesse. Le cellule vengono incubate per microiniettati vari momenti poi fissa e la localizzazione sub-cellulare di RNA è valutata mediante FISH. A differenza di transfezione, dove la trascrizione avviene alcune ore dopo l'aggiunta di acidi nucleici, la microiniezione di DNA o mRNA permette di espressione rapida e consente la generazione di precisi dati cinetici.

Protocollo

Ci sono due metodi microiniezione-based che può essere utilizzato per misurare la cinetica di esportazione mRNA in cellule di mammifero, iniezione di mRNA sintetizzato in vitro, o il DNA plasmide, che viene trascritto in vivo in mRNA. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi. Qui si descrivono entrambe le tecniche e discutere le differenze tra i due approcci.

1. Preparazione di materiali per l'iniezione

1. In vitro mRNA trascritto
   1. mRNA è trascritto da entrambi i plasmidi o prodotti PCR che contengono il gene di interesse fiancheggiato a monte da parte appropriata promotore RNA polimerasi (cioè T7 o SP6 promotori). La trascrizione è effettuata in vitro utilizzando l'enzima appropriato (T7 o SP6 RNA polimerasi, Invitrogen) con nucleotidi appropriati e analogici cappuccio in eccesso.
   2. Trascrizioni sono polyadenylated in vitro utilizzando Poly-A-polimerasi (Invitrogen) e ATP secondo protocolli del produttore.
   3. L'mRNA viene poi purificato tramite colonne sia da Invitrogen o Qiagen.
   4. MRNA eluite sono poi precipitati con l'aggiunta di 1/20th volume di acetato di potassio 3M e 2 volumi di etanolo 100% a -20 ° C per un'ora seguita da centrifugazione a 13.000 g a 4 ° C per 30 min. Se il liquido in eccesso è presente, il pellet può essere lavato con etanolo ghiacciata 70%.
   5. Il risultante mRNA pellet è dotata di aria secca poi disciolti in tampone di iniezione (140mm KCl e HEPES 10 mM, pH 7,4). Si noti che l'etanolo qualsiasi contaminante può essere tossico per la cellula microiniettati. L'mRNA solubilizzato possono essere conservati a -80 ° C per la conservazione a lungo termine.
   6. Per la microiniezione, mRNA è diluito a 200μg/ml nel buffer di iniezione e mescolato con Oregon Verde 488 (OG)-coniugato 70kDa destrano (1mg/ml, Invitrogen). Dato che la OG-coniugato destrano è troppo grande per diffondere attraverso il poro nucleare, permetterà non solo di identificare cellule iniettate, ma anche contribuire a determinare la quantità del liquido è stato iniettato nel nucleo e quanto trapelato nel citoplasma ( vedere 4.1.2). In alternativa, le fluorescenti, molecola ad alto peso molecolare che non è in grado di attraversare il poro nucleare può essere utilizzata.
   7. I campioni vengono centrifugati a 13.000 g a 4 ° C per almeno 20 minuti prima di caricare l'ago al fine di espellere qualunque materiale che possono potenzialmente ostacolare la punta dell'ago.
2. DNA plasmidico
   1. DNA plasmidico contenente il gene di interesse può essere preparato utilizzando le normali kit di purificazione del DNA da Qiagen. Preparazioni del DNA generalmente più grandi tendono ad essere di qualità superiore e sono quindi più efficiente trascritti dopo l'iniezione.
   2. DNA plasmidico è diluito al 50 per 200μg/ml nel buffer di iniezione contenente OG-coniugato 70 kDa destrano (1mg/ml).
   3. Prima di caricare l'ago, l'iniezione del liquido viene centrifugato a 13.000 g a 4 ° C per almeno 20 minuti.
3. Aghi per microiniezione
   1. Gli aghi sono fabbricati da 1,0 millimetri tubi in vetro borosilicato capillare (Articolo # 1B100F-3; Mondiale Precision Instruments Inc.) utilizzando un Sutter p97 Flaming / Brown Micropipetta Estrattore con un filamento da 2,5 mm.
   2. Gli aghi di iniezione sono generati utilizzando un programma in tre fasi tirando con un filamento box 2.5x4.5 mm (voce # FB245B, Sutter Instrument Co.). I parametri del programma utilizzato in questo esperimento sono elencati di seguito, tuttavia essi devono essere ottimizzate per ogni filamento.

      Step #	Calore	Tirare	Velocità	Tempo	Pressione
      1	740	100	8	250	500
      2	740	100	8	250	500
      3	740	100	10	250	500

      
      (Temperatura rampa = 740)
4. Preparazione delle cellule
   1. Generalmente ogni linea di cellule di mammifero può essere microiniettati, tuttavia tipi di cellule che sono ben distribuiti tendono ad essere più suscettibili di iniezione. La scelta della linea cellulare può dipendere anche da altri fattori. Per esempio, mRNA che codificano per proteine ​​secrete sono mirati alla superficie del reticolo endoplasmatico e questo è molto più visibile nelle cellule COS-7 rispetto ai fibroblasti NIH 3T3 ⁶ (confrontare la localizzazione di t-FTZ Δi-mRNA nelle figure 3 e 4).
   2. Le cellule devono essere seminate su vetrini piazza lavata con acido (25x25mm) in petridishes 30 mm per almeno 24 ore prima della microiniezione. In linee cellulari di alcuni, la diffusione può essere stimolata dalle cellule placcatura su vetrini rivestiti di fibronectina ^6,8. Idealmente il monostrato cellulare dovrebbe essere circa il 70-90% confluenti al momento dell'iniezione.
   3. Per consentire una facile identificazione delle cellule iniettate, il monostrato cellulare è ferito prima dell'iniezione utilizzando un 200μl puntale in plastica. Generalmente una ferita croce (Figura 1) è inciso sul vetrino e le cellule vengono lasciate a recuperare per almeno 15 minuti prima dell'iniezione nel tessuto culturale incubatore.
   4. Durante la microiniezione, terreni di coltura di tessuto perde lentamente di CO ₂ per diffusione e di conseguenza diventa alcalino. Per aiutare a mantenere un pH neutro durante l'iniezione, i media possono essere integrati con HEPES 10mM pH 7,4. Il buffer può essere aggiunto ai media il giorno prima microiniezione.
5. Il microscopio e Micromanipolatore
   1. Le cellule sono microiniettati utilizzando un microscopio invertito che è isolato su un tavolo d'aria per ridurre al minimo le vibrazioni che può essere dannoso per il processo di microiniezione. Il microscopio è dotato di due obiettivi: un pezzo secco 10x, che viene utilizzato per posizionare le celle e l'ago, e un secco 40 volte più lunga distanza oggettiva fase di lavoro, che viene utilizzato per l'immagine del processo di microiniezione.
   2. Aberrazioni ottiche causate dalle cellule visualizzando tutto il coprioggetto e petridish può essere eliminato se l'obiettivo ha un collare di correzione. Garantire che brightfield del microscopio sia correttamente allineato per illuminazione Köhler ^9, aiuterà anche a correggere le aberrazioni causate dalla luce viene diffusa dalla ago per l'iniezione (vedi 2.2.4).
   3. L'ago è controllato da un dispositivo a tre assi del joystick appeso micromanipolazione (NT-88-V3MSH, Narishige). Il manipolatore grossolana è fissato al montante posteriore del microscopio per consentire l'ago di essere facilmente sollevato e abbassato nel piatto, pur mantenendo la sua posizione originale.
   4. L'ago è fissato ad una bacchetta che è fissato al manipolatore grossolana. Un tubicino collega la bacchetta di una siringa di vetro 5cc (Item # 512311, Becton Dickinson), che genera la pressione di iniezione necessaria per espellere liquido dalla punta dell'ago microiniezione. Per controllare il livello di pressione, il corpo della siringa e il pistone sono tenuti in posizione da un regolatore di siringa che si compone di due tappi, un morsetto tubo (disponibile presso qualsiasi negozio di ferramenta) e due fascette metalliche (Figura 2). Per assicurarsi che la siringa mantiene la pressione alta, grassi vuoto (Dow Corning) viene applicato lo stantuffo della siringa.
6. La sonda di ibridazione fluorescente
   1. La sequenza primaria del iniettato acido nucleico è piegato utilizzando RNA software previsione della struttura secondaria, come ad esempio RNAstructure 4.6 ^10.
   2. Le pieghe mRNA sono valutati visivamente per identificare una regione di circa 50 nucleotidi che tende ad essere priva di strutture secondarie con temperature di fusione elevate, ad esempio lunghi filamenti doppi.
   3. Il complemento inverso di questa regione è sintetizzato con un fluoroforo Alexa546 attaccato al 5 'della sonda (queste possono essere acquistati presso Integrated Technologies DNA).
   4. La sonda viene diluito con acqua ad una concentrazione di 100μM e conservati a -80 ° C per 2-3 anni.

2. Microiniezione intranucleari

1. Caricamento del fluido di iniezione sul microscopio microiniezione
   1. Circa 1ml di liquido ad iniezione è tratto dal DNA centrifugati o del campione di mRNA usandoGELoader punte (Articolo # 022351656; Epindorff). Liquido deve essere aspirata dalla parte superiore del campione per evitare di disturbare il pellet che contiene particelle che possono ostruire l'ago.
   2. La punta della pipetta viene inserita nel back-end dell'ago e il liquido viene espulso. Liquido saranno attratti dalla punta dell'ago per azione capillare e un menisco in prossimità della punta dovrebbe essere visibile in 5-30sec.
   3. Il pieno di liquido ago viene inserito nel bacchetta, che viene poi fissata al micromanipolatore con un angolo di 45 °.
   4. L'ago viene visualizzato con l'obiettivo 10x ed è posizionato al centro del piano visivo vicino al piano focale utilizzando le manopole micromanipolatore grossolana. L'ago viene poi sollevato di pochi millimetri per evitare che venga danneggiato in fasi successive (2.2.2) e poi il pilastro posteriore microscopio è spinto indietro.
   5. La pressione è aumentata lo stantuffo 0,5-2cc.
2. Microiniezione
   1. Un petridish contenente una copertura antiscivolo con un monostrato ferito è posto sul palco di visualizzazione.
   2. Il pilastro di nuovo microscopio è tirato avanti per una posizione eretta, causando il condensatore ad essere allineati e l'ago per immettere il liquido. Questo dovrebbe essere fatto con attenzione per evitare che l'ago dalla rottura sul coprioggetti (vedi 2.1.4).
   3. Utilizzando l'obiettivo 10x, il centro della ferita croce è identificato e l'ago è posizionato sopra le cellule da iniettare.
   4. L'ingrandimento è aumentato passando per l'obiettivo 40x e l'ago si abbassa e centrata utilizzando le manopole di regolazione fine sul joystick. Se l'immagine è fuori fuoco, si deve assicurare che la luce incidente è allineato correttamente (cioè KOLHER illuminazione ⁹⁾ utilizzando una lente di Bertrand (vedi 1.5.2).
   5. L'iniezione deve iniziare in un angolo della croce ferita e continua lungo un bordo per una facile identificazione delle cellule iniettate durante la visualizzazione (vedi Figura 1).
   6. L'ago si abbassa a prendere contatto con il nucleo. Si può facilmente dire che una cellula è stata iniettata dal cambiamento notevole luminosità fase che accompagna l'iniezione.
   7. Se il liquido riempie l'intera cella può indicare che la pressione è troppo alta e deve essere abbassata.
   8. Se nessun cambiamento di luminosità fase viene rilevato, questo può indicare che sia la pressione di microiniezione non è abbastanza forte per forare la membrana cellulare, o che la punta dell'ago è intasato. Questo può essere il risultato di una serie di questioni tra cui: pressione insufficiente, imperfezioni l'ago, e il blocco della punta dell'ago con il particolato di piccole dimensioni. Dal momento che il caricamento di ogni ago nel micromanipolatore richiede molto tempo, e dato che il substrato di iniezione è spesso molto prezioso, è importante per massimizzare la percentuale di aghi che può essere efficacemente utilizzato per preparazioni iniettabili. Di seguito è riportato un passo-passo guida per cercare di sbloccare una punta intasato ago. Dopo ogni passaggio, si dovrebbe cercare di iniettare 2-3cells per valutare se l'ostruzione è stata rimossa:

      	Azione	Finalità e Obiettivi
      1	La messa a fuoco per visualizzare la lunghezza della punta dell'ago.	Per determinare se vi è una imperfezione evidente nel dell'ago o se ci sia un grosso pezzo di particolato bloccare la punta.
      2	Posizionare la punta dell'ago accanto a un pezzo galleggiante di particolato nel piatto.	Se il liquido sta uscendo la punta dovrebbe agitare la particella senza entrare in contatto diretto con l'ago.
      3	Spingere il pistone fino alla fine della siringa	Questo aumento temporaneo della pressione dovrebbe cancellare eventuali ostruzioni alla punta. Dopo aver rilasciato lo stantuffo, dovrebbe sorgere sulla sua spontanea volontà, se non, ciò significa che la pressione non viene edificata nella siringa ed è necessario stringere i collegamenti e / o aggiungere grasso additional vuoto.
      4	Sollevare l'ago della cellula media	La forza del disegno l'ago del mezzo acquoso può aiutare a rimuovere ostacoli alla punta dell'ago.
      5	Togliere lo stantuffo dalla siringa completamente e reinserirla.	Questo ulteriore aumento della pressione può essere richiesto di cancellare la punta dell'ago.
      6	Graffiare la punta dell'ago su una parte pulita del coprioggetto	Questo ulteriore agita il particolato all'interno l'ago e aiuta riposizionarlo per alleviare l'ostruzione alla punta. Più forte di chip può graffiare l'estremità della punta, permettendo l'ostruzione per uscire l'ago.
      7	Caricare un nuovo ago

      
      
      Un altro problema comune è la graduale perdita di pressione all'interno dell'ago, che richiedono compensazione frequenti ulteriormente lo stantuffo della siringa. Spesso, l'aggiunta di grasso supplementare vuoto per lo stantuffo della siringa può aiutare a mantenere la pressione più costante. Tuttavia questo problema può essere dovuto a perdite le connessioni tra siringa e tubo, il tubo e la bacchetta, o la bacchetta e l'ago. La maggior parte delle perdite d'aria possono essere sigillati con Parafilm (Fisher) o grasso, se necessario, anche se le perdite tra la bacchetta e ago può essere corretto solo cambiando la guarnizione di gomma nel bacchetta.
   9. Cellule lungo un bordo ferita sono microiniettati lungo il bordo della ferita per un determinato periodo di tempo (10-15min). Con la pratica diverse centinaia di cellule possono essere iniettati durante questo intervallo.
   10. Dopo la microiniezione, le cellule vengono incubate a 37 ° C in un incubatore di coltura per la quantità desiderata di tempo prima di fissazione. Se l'iniezione del DNA, la trascrizione termina dopo 20 minuti trattando le cellule con α-amanitina (1μg/ml; Sigma-Aldrich) disciolto in terreni di crescita. Questa concentrazione inibisce in modo efficace la trascrizione dal plasmide microiniettati (Figura 3).
   11. Un ago singolo può essere riutilizzato per iniettare vetrini multipli, anche se l'ago deve essere sostituito quando si cambia il tipo di DNA o RNA che è microiniettati. Una volta che l'ago viene rimosso dalla bacchetta è devono essere smaltiti e non riutilizzato.
   12. Le cellule morte o galleggianti occasionalmente aderire alla punta dell'ago e può interferire con microiniezione. Per rimuovere questo detriti l'ago, sollevare l'ago del liquido spingendo indietro il pilastro e poi lentamente reinserire l'ago nel liquido regolando il pilastro in posizione verticale.
   13. Per ottenere una misurazione precisa della misura nucleare mRNA esportazione cinetica, campioni separati dovrebbe essere fissato a 0min, 15min, 30min, 60min e 120 minuti di post-RNA microiniezione, o dopo α-amanitina trattamento.

3. Fissazione e colorazione delle cellule

1. Fissazione delle cellule e permeabilizzazione
   1. Al momento opportuno, i media la crescita è aspirato e le cellule vengono lavate due volte con 2 ml di soluzione PBS (137mm NaCl, KCl 2,7, 10mM Na ₂ HPO _4, 2mm KH ₂ PO _4, pH 7,4). E 'importante mantenere i coprioggetti umida riducendo al minimo il tempo che non sono immersi in un liquido.
   2. Le cellule vengono fissate con l'aggiunta di 2 ml di paraformaldeide al 4% (Scienze Electron Microscope) in PBS per almeno 15 minuti a temperatura ambiente.
   3. I campioni fissati vengono lavati due volte con la soluzione PBS.
   4. Le cellule sono permeabilizzate con 2 ml di 0.1% Triton X-100 in PBS per almeno 15 minuti a temperatura ambiente.
   5. I campioni vengono lavati due volte con la soluzione PBS.
2. PESCE colorazione
   1. Avanti i campioni devono essere preparati per l'ibridazione. Le cellule vengono lavate due volte con la soluzione 1x SSC (NaCl 150mm, 15mm citrato di sodio, pH 7,0) con il 25-60% formimide. Per la quantità di formammide, utilizzare la stessa concentrazione che è presente nella soluzione di ibridazione (vedi 3.2.3).
   2. Per preparare la camera di colorazione, il fondo di una petridish 150 millimetri è ricoperta d'acqua e un pezzo di Parafilm è galleggiare sull'acqua. L'acqua viene rimossa girando il piatto finito, permettendo così al Parafilm di aderire al fondo del piatto. Bolle d'aria sono ricreare manualmentemosso.
   3. Per ogni vetrino da colorare, gocce 100μl della soluzione di ibridazione (25-60% formammide, 100mg/ml destrano solfato, 1mg/ml E. coli tRNA, 5mm complesso riboside vanadil in 1x SSC con sonda diluito 1:500) sono pipettati sul parafilm. Si noti che la quantità di formammide dovrebbe essere ottimizzato per la sonda FISH particolare utilizzato.
   4. Con l'aiuto di pinze, un coprioggetto viene rimosso da un petridish 30mm, poi con filtro di carta Whatman (VWR) il lato posteriore (cell-free lato) del vetrino del buffer è secca e l'eccesso è malvagio dalla parte anteriore senza asciugare il fisso cellule. Il coprioggetto viene quindi posto a faccia in giù sulla soluzione FISH. Questo si ripete per ogni coprioggetto.
   5. Dopo aver posizionato il coperchio della camera di macchie sulla schiena, i campioni vengono incubati per 5-18hrs a 37 ° C.
3. Lavaggio e montaggio dei Campioni Stained
   1. Camere di lavaggio diversi sono realizzati nello stesso modo come la camera di colorazione (vedi 3.2.2).
   2. Per ogni coprioggetto, 1 ml di tampone di lavaggio (1x SCC con il 25-60% formammide) è pipettati sul parafilm della camera di lavaggio. Anche in questo caso, utilizzare la stessa concentrazione di formammide che è presente nella soluzione di ibridazione (vedi 3.2.3).
   3. Per rimuovere i coprioggetti dalla camera di colorazione, 1ml di tampone di lavaggio pipettati accanto al coprioggetto. Il liquido deve essere disegnate sotto ogni campione per capillarità.
   4. Utilizzando pinze, i coprioggetti vengono rimossi e ciascuno è collocato sulla goccia di tampone di lavaggio e incubate a temperatura ambiente per 5 min.
   5. Passi 3.3.2 a 3.3.4 sono ripetuti due volte, in modo che ogni vetrino viene lavato per un totale di 3 volte.
   6. Se l'RNA deve essere costained con alcune proteine ​​mediante immunofluorescenza, vedere paragrafo 3.4.
   7. Le diapositive vengono lavati con etanolo al 70%, e asciugati con Kimwipes. Per ogni coprioggetto, 10-30 ml di soluzione di montaggio con DAPI (Fluoromount G, Sud Biotech) è pipettati sul diapositive. Ogni diapositiva può ospitare due lamelle.
   8. Con pinze e Whatman carta da filtro, la parte posteriore del coprioggetto è asciugato e il liquido in eccesso è malvagio fuori il lato anteriore del coprioggetto senza seccare i campioni. Ogni vetrino viene quindi posto a faccia in giù, sulla goccia di soluzione di montaggio.
   9. Campioni possono essere montati conservare a 4 ° C.
4. Immunofluorescenza
   1. I campioni devono essere lavate due volte con PBS per rimuovere formammide che possono interferire con la colorazione anticorpale adeguata.
   2. Per ogni coprioggetti, 50μl della soluzione di anticorpo primario (anticorpo 1.0μg/ml, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml RNasi-free BSA in PBS) è pipettati sul parafilm di una camera di lavaggio.
   3. Utilizzando pinze, coprioggetto sono affiancate delle cellule verso il basso sulla soluzione di anticorpo primario e lasciato incubare a temperatura ambiente per 30 min.
   4. Per ogni coprioggetti, due gocce 1 ml di PBS sono pipettati sul parafilm di una camera di lavaggio.
   5. Per rimuovere i coprioggetti dai soluzione colorante anticorpi, 1 ml di PBS è pipettato accanto al coprioggetto. Il liquido deve essere disegnate sotto ogni campione per capillarità.
   6. Utilizzando pinze, i coprioggetti vengono rimossi e ciascuno è collocato sulla prima goccia di PBS per 5 minuti e poi messo su la seconda goccia di PBS per altri 5min.
   7. Passi da 3.4.2 a 3.4.6 sono ripetuti utilizzando la soluzione fluorescente anticorpo secondario (anticorpo 1.0μg/ml, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml BSA in PBS). Da notare che da quando l'indicatore di iniezione e l'RNA sono visibili nel canale verde e rosso, l'anticorpo secondario deve essere coniugato con un colorante compatibile come Alexa647.
   8. Coprioggetto sono montati come in 3.3.7.

4. Imaging e quantificazione

1. Imaging
   1. Un microscopio a epifluorescenza è usato per l'immagine delle cellule dopo l'iniezione. Cellule iniettate si trova individuando le ferite croce e l'identificazione delle cellule iniettate con pennarello (OG-destrano).
   2. Per ogni cella osservata, una foto del iniettato OG-destrano è acquisito. Quando l'imaging microiniettati mRNA è importante che la quantificazione è limitata alle cellule che hanno ricevuto> 90% del liquido iniettato (es. destrano) nel nucleo.
   3. Un'immagine della RNA viene poi acquisita. Per consentire la misurazione accurata di RNA, il tempo di esposizione tra tutte le celle all'interno di un corso dato momento dovrebbe rimanere costante e rientrano nella gamma dinamica della fotocamera. Idealmente ogni immagine dovrebbe includere una cella uninjected essere in grado di calcolare la propria fluorescenza di fondo integrazionensity (vedi 4.2.4).
   4. Per facilitare la quantificazione, l'immagine della macchia DAPI possono anche essere acquistati. Anche se immunofluorescenza è stata eseguita, la proteina può anche essere macchiato ripreso. Un esempio di distribuzione mRNA in diversi punti ad un corso di tempo è mostrata in Figura 4. L'mRNA codifica per una proteina secreta ed è quindi mirato al pronto soccorso in cellule COS-7. Si noti che la ER-targeting è stata verificata dal co-colorazione l'RNA con anticorpi contro TRAPα, una proteina residente ER ^11.
2. Quantificazione
   
   Questo può essere realizzato con una serie di diversi pacchetti software di analisi dell'immagine. ImageJ software è particolarmente adatto per quantificare la distribuzione cellulare mRNA in quanto può essere usato per separare manualmente frazioni nucleari e citoplasmatici, è in grado di misurare la fluorescenza media di queste frazioni, ed i suoi dati in uscita possono essere facilmente copiati e incollati in altri software, come ad esempio Microsoft Excel.
   1. Immagini corrispondenti alla FISH, OG-destrano, e fluorescenza DAPI sono aperti e fuse con le immagini di Stack strumento.
   2. In entrambi i DAPI o destrano strato lo strumento Soglia è utilizzato per isolare l'area corrispondente al nucleo microiniettati. Questa frazione viene selezionato con la bacchetta, e dopo essersi trasferito allo strato PESCE, l'area (A _NUC) e media / media intensità (F _NUC) sono registrati utilizzando lo strumento Misura.
   3. Il perimetro è delineato cellulare utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, e mentre sullo strato PESCE l'area (un _tot) e media / media intensità (F _Tot) sono registrati utilizzando lo strumento Misura. Se fluorescenza tua cella è molto più intensa di quella dello sfondo, è possibile utilizzare lo strumento Soglia invece lo strumento di selezione a mano libera per delineare la vostra cella desiderata.
   4. Utilizzando la funzione di selezione rettangolare, una scatola è disegnato su una cella uninjected e l'intensità media / media (F _Back) viene registrato.
   5. Tutte le misurazioni vengono copiati in un foglio di excel.
   6. MRNA esportati sono calcolati utilizzando la seguente equazione:
      
      

      Un Nuc	Area del nucleo
      Un Tot	Area di tutta la cella
      F Nuc	Fluorescenza media della frazione nucleare
      F Tot	Fluorescenza media della frazione cellula intera
      F Indietro	Fluorescenza media di una cellula untransfected

      
      Per ogni punto temporale di esportazione% medio è calcolato e tracciato nel corso del tempo.
   7. Stabilità mRNA viene calcolato tracciando la fluorescenza media mRNA totale (A x _Tot (F _Tot - F _indietro)) nel corso del tempo. Di solito troviamo che quantità di mRNA varia notevolmente tra le cellule e tra le lamelle. Questo può essere causa di incongruenze tra i tassi di flusso tra ago e l'efficienza della colorazione FISH.

Figura 1. Cellule coprioggetto microiniezione. Sono cresciuti fino a che non sono il 70-90% confluenti poi ferito verticalmente e orizzontalmente con una 200μl puntale in plastica. A partire dalla croce-ferita, le cellule vengono iniettate lungo un bordo della ferita (freccia).

Figura 2. Regolatore siringa. A) diagramma di flusso che dimostra come il regolatore siringa è assemblato. B) Schema degli apparati montati. C) Una fotografia del regolatore siringa assemblato.

Figura 3. Effetti della α-amanitina sulla trascrizione del DNA plasmidico iniettato. NIH3T3 fibroblasti, che sono stati pre-trattati con differenti concentrazionis di α-amanitina, sono stati iniettati con t-FTZ-Δi plasmide DNA e OG-coniugato 70kD destrano. Cellule iniettate sono state incubate a 37 ° C per 1 ora e poi fissate e colorate per t-FTZ-Δi mRNA usando un PESCE specifico probe6. Ogni riga corrisponde ad un unico campo visivo ripreso per OG-70kDa destrano e t-FTZ-Δi mRNA. Si noti che alta, ma non basse, le concentrazioni di farmaco totalmente inibita la produzione di t-FTZ-Δi trascrizione. Barra di scala = 15μm.

Figura 4. Naturalmente momento dell'esportazione mRNA nucleare. Cellule COS-7 sono stati iniettati con t-FTZ-Δi DNA plasmidico e OG-coniugato 70kD destrano. 30 minuti dopo l'iniezione delle cellule sono state trattate con α-amanitina e incubate a 37 ° C per i punti di tempo indicato. Le cellule sono state poi fissate e colorate con sonda contro t-FTZ-Δi mRNA e con anticorpi contro il marcatore ER TRAPα. Ogni riga corrisponde ad un singolo campo di cellule. A) la distribuzione di mRNA a seguito di un timecourse microiniezione. B) A far saltare in aria del punto di tempo da 120 minuti (A) dimostrare la co-localizzazione di t-FTZ-Δi mRNA e al pronto soccorso. Una sovrapposizione delle t-FTZ-Δi mRNA (verde) e TRAPα (rosso) colorazione è mostrato nel pannello di destra. Barre di scala = 15μm.

Discussione

Microiniezione è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare una serie di diversi processi cellulari. A differenza di transfezione delle cellule convenzionali, microiniezione consente al ricercatore di introdurre efficacemente gli acidi nucleici all'interno dei nuclei cellulari in tempi molto stretti. Come risultato, si può eseguire analisi cinetiche come determinare il tasso di esportazione mRNA, localizzazione mRNA, e la sintesi proteica. Inoltre, poiché il periodo dell'esperimento è relativamente breve, si può esporre le cellule di composti tossici in intervalli di tempo brevi, senza incorrere in effetti pleiotropici. Inoltre, composti inibitori o stimolatori, come dominante negativo proteine, può essere co-iniettata con gli acidi nucleici. Infine, microiniezioni evitare il requisito per i reagenti di trasfezione, che spesso sono tossici per le cellule e possono turbare diverse funzioni cellulari.

mRNA vs iniezioni di DNA plasmidico

La scelta di quale acido nucleico per iniettare dipenderà da una serie di considerazioni. Dopo l'iniezione plasmide DNA, l'RNA polimerasi II non solo sintetizza mRNA, ma anche fattori recluta proteine ​​per la trascrizione nascente ^12,13. Dal momento che questi fattori governano gli eventi come l'elaborazione di mRNA, l'esportazione nucleare e di localizzazione citoplasmatica, iniezioni di DNA plasmidico può essere utilizzato per valutare come la trascrizione è accoppiata a processi a valle. Anche se la trascrizione può essere accoppiato ad esportare nucleare ^14, abbiamo trovato che l'mRNA iniettata viene esportato un po 'più veloce in vivo mRNA trascritto ^6. Le ragioni di ciò non sono chiare al momento, ma questo risultato potrebbe suggerire che come l'mRNA di nuova sintesi emerge dalla RNA polimerasi II, può essere legato a complessi che ritardano l'esportazione nucleare.

Ci sono alcuni vantaggi con iniezioni mRNA. In primo luogo, il ricercatore non deve usare gli inibitori della polimerasi RNA, che potrebbe incidere come le cellule regolano il metabolismo generale di RNA. In secondo luogo, l'RNA può essere modificato in vitro prima dell'iniezione. Per esempio, mRNA può essere sintetizzato con le varie 5 'analoghi cappuccio o poli (A) lunghezze di coda al fine di valutare come queste caratteristiche influiscono esportazione nucleare ^6. In terzo luogo, l'esatta quantità di RNA che viene iniettato può essere approssimativamente stimato. Seguendo il protocollo di cui sopra, si stima che circa 20.000 a 50.000 molecole vengono iniettati in ogni nucleo, che è relativamente piccolo rispetto al numero totale di trascrizioni in una tipica cellula di mammifero (400.000 a 850.000 molecole) ^15. Il principale svantaggio con iniezioni di mRNA è che durante la microiniezione, qualche perdita di liquido ad iniezione nel citoplasma è inevitabile. Dal momento che l'mRNA iniettato direttamente nel citoplasma è stabile per lunghi periodi (A. Palazzo, osservazione inedito), particolare attenzione deve essere presa per selezionare quali cellule sono quantificati. Generalmente si analizzano le cellule che hanno ricevuto> 90% del fluido di iniezione nel nucleo, valutato mediante la distribuzione di OG-destrano.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tampone per iniezione	Sigma-Aldrich		140 mM KCl e 10 mM HEPES, pH 7,4
Oregon Green 488-70kD Destrano	Invitrogen	D7173	Stock di 10 mg/ml in tampone per iniezione può essere conservato per lunghi periodi di tempo a -80° C
Tubi capillari in borosilicato	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Punte per pipette di caricamento gel per il caricamento di aghi per iniezione Eppendorf		022351656
Microscopio	Nikon Instruments	Eclipse Ti-S
Micromanipolatore	Narishige International	NT-88-V3MSH
Siringa per iniezione	BD Biosciences	512311
PBS Buffer	Sigma-Aldrich		137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4
SSC Tampone	Sigma-Aldrich		150 mM NaCl, 15 mM citrato di sodio, pH 7,4
4% Paraformaldeide	Microscopia elettronica Scienze	15686	Stock di 37% Paraformaldeide è diluito in PBS
0,1% Triton X-100 (Surfact-Amps)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	28314	Stock di Triton X-100 al 10% è diluito in PBS
Formamide	Fisher Scientific	F84-1
Destrano solfato	Fisher Scientific	BP1585-100
E. coli tRNA	Sigma-Aldrich	R1753
Vanadyl riboside complex (VRC)	Sigma-Aldrich	R3380
Whatman carta da filtro	VWR internazionale	28298-020
Tabella di controllo delle vibrazioni	Kinetic Systems	5702E-3036-21
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
α-amanitin	Sigma-Aldrich	A2263
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone	Sutter Instrument Co.	P-97
Grasso per vuoto	Dow Corning	695400008
T7 RNA polimerasi	New England Biolabs	M0251S
Poli(A) Polimerasi	Ambion	AM1350
Tampone di ibridazione	Sigma-Aldrich		100 mg/ml destrano solfato, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM citrato di sodio, 0,5 mg/ml E. coli tRNA, 60% formammide