Impianto di cannula nella Cisterna Magna in un modello murino

Abstract

Fonte: Xavier, A. L. R., et al. Impianto di cannule nella Cisterna Magna dei Roditori. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra la procedura per l'impianto di una cannula nella cisterna magna di un topo anestetizzato. La tecnica consiste nel guidare una cannula montata su ago attraverso la dura madre nella cisterna magna triangolare invertita e fissarla per una somministrazione mirata nel liquido cerebrospinale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

Procedura chirurgica
NOTA: L'incannulamento cronico della cisterna magna (CM) consente agli animali di riprendersi dalla procedura chirurgica. Le iniezioni di CM vengono effettuate il giorno successivo all'impianto della cannula e, soprattutto, possono essere eseguite sia in animali anestetizzati che svegli. Poiché si tratta di un intervento chirurgico di recupero, le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili.
1. Pesa il topo (C57BL/6JRj, entrambi i sessi, 8 settimane) e anestetizzalo con una miscela di ketamina e xilazina (100 mg/kg; 10 mg/kg, rispettivamente) tramite iniezione intraperitoneale (i.p.). Se necessario, ridosare il topo con mezza dose di ketamina (50 mg/kg) durante la procedura chirurgica. In alternativa, per l'incannulamento cronico, anestetizzare il topo inserendolo in una camera di induzione dell'isoflurano al 2,5 - 3% di isoflurano, a circa 1 L/min di ossigeno (O₂). In questo caso, utilizzare un cono nasale per sostenere l'anestesia con isoflurano all'1,5 - 2% durante l'intervento chirurgico.
2. Quando i riflessi di pizzicamento delle dita dei piedi cessano e la respirazione diventa lenta e costante, posizionare l'animale in un telaio stereotassico su un termoforo.
3. Applicare un unguento oftalmico. Ripetere l'operazione durante l'intervento chirurgico ogni volta che è necessario.
4. Radere la testa e il collo del topo, rimuovere il pelo e sterilizzare la pelle esposta prima con un tampone imbevuto di alcol e poi due volte con clorexidina (0,5%) o soluzione di iodio (2%). Ripetere la sterilizzazione altre due volte.
  NOTA: Cambiare il telo chirurgico per rimuovere detriti e peli dopo la rasatura. Quindi, drappeggia l'animale per proteggere il campo sterile.
5. Per l'incannulamento cronico, somministrare 0,5 - 1 ml di lidocaina/bupivacaina (1 mg/ml e 0,25 mg/ml, rispettivamente) per via sottocutanea (s.c.) nel sito di incisione. Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg; s.c.) per l'analgesia post-chirurgica.
6. Fissa il mouse nel fotogramma stereotassico. Dopo aver assicurato la fissazione, intraaurale o tramite l'arco zigomatico, inclinare leggermente la testa in modo che formi un angolo di 120° rispetto al corpo (Figura 1E).
7. Trova la parte del cranio che sporge immediatamente sopra i muscoli del collo: la cresta occipitale. Sollevare la pelle sovrastante con un paio di pinzette e tagliare un pezzo di pelle a forma di mandorla di circa 1 cm lungo la linea mediana. Utilizzare tamponi di cotone o lance oculari per controllare l'eventuale sanguinamento risultante.
8. Usando la cresta occipitale come punto di riferimento, separare il tessuto connettivo superficiale per esporre i muscoli del collo sottostanti.
9. Separare i muscoli sulla linea mediana facendo scorrere con cura la pinza lungo il centro del sito di incisione nell'asse anteriore-posteriore. Con un paio di pinze curve in ciascuna mano, unisci le punte al centro vicino alla parte inferiore del cranio e tira da parte i muscoli.
  NOTA: Questo dovrebbe esporre il CM, che appare come un minuscolo triangolo rovesciato, delineato dal cervelletto sopra e dal midollo sotto, dietro la membrana durale traslucida (Figura 1B e 1C).
10. Utilizzando un occhiello chirurgico o un batuffolo di cotone, pulire la membrana durale che copre il CM.
Inserimento della cannula nel CM
1. Rimuovere la cannula dalla siringa riempita di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF), mantenendo l'ago da 30G attaccato all'estremità posteriore del tubo.
2. Collegare l'ago da 30G a una siringa da 100 μL riempita di acqua distillata collegata a una pompa a siringa.
3. Inserire una bolla d'aria di circa 1 cm nella cannula prelevando aria con l'ausilio di una pompa a siringa.
4. Utilizzando una pompa a siringa, prelevare 12 μl del tracciante del liquido cerebrospinale (CSF) desiderato nella cannula.
5. Afferrare la cannula, riempita con il tracciante del liquido cerebrospinale, vicino all'ago coperto dal tubo con un paio di pinzette curve tenute nella mano dominante. Appoggiare il dito medio della mano non dominante sulla barra auricolare del lato opposto e tenerlo fermo per un uso successivo come appoggio per la cannula.
6. Inserire la cannula con un angolo di 45° rispetto alla testa del topo, passando al centro del CM, identificato dal suo aspetto triangolare visto attraverso la dura. Evitare qualsiasi penetrazione del cervelletto o del midollo. Assicurarsi che l'ago sia inserito solo a una profondità di 1 - 2 mm, ad esempio fino al punto in cui lo smusso si trova interamente sotto la dura. Rilascia le pinzette che tengono la cannula e lascia che la cannula poggi sulla mano non dominante.
  NOTA: L'estremità smussata degli aghi dentali richiederà l'applicazione di una certa forza per perforare la membrana durale che copre il CM.
7. Se necessario, asciugare eventuali perdite di liquido cerebrospinale durante la penetrazione utilizzando una lancia chirurgica o tamponi di cotone.
8. Applicare 2-3 gocce di colla cianoacrilica sulla membrana durale che circonda la cannula. Aggiungi una goccia di acceleratore di colla per polimerizzare immediatamente la colla. Coprire il cranio e l'ago con una miscela di cemento dentale (circa 0,5 mg) e colla cianoacrilica (3 - 5 gocce). Subito dopo, applicare una goccia di acceleratore di colla per polimerizzare.

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Risultati

Figura 1: Iniezione di traccianti nella cisterna magna. (A) Panoramica schematica della testa e del cervello del topo che mostra la posizione della cisterna magna (CM) in relazione al cervello e alle strutture craniche. (B) Mi...