Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Iniezione di cellule marcate nell'organoide cerebrale
NOTA: Per questo documento, gli organoidi cerebrali sono stati prodotti utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore. Questo può essere sostituito con l'organoide cerebrale di interesse. I materiali utilizzati in questa parte del protocollo devono essere preraffreddati per evitare la gelificazione della matrice solubilizzata della membrana basale a temperature superiori a 4 °C.
- Posizionare la siringa/e da insulina/e, le punte e i tubi che verranno a contatto con la matrice della membrana basale solubilizzata a -20 °C per farli raffreddare.
- Scongelare un'aliquota di dimensioni adeguate di matrice di membrana basale solubilizzata su ghiaccio, a seconda del numero di iniezioni che verranno eseguite (~2 μL/iniezione). L'operazione dura circa 30 minuti.
- Mentre l'aliquota si scongela, dividere, raccogliere e contare le cellule.
- Calcolare i volumi necessari per ogni iniezione. Se si eseguono più iniezioni, posizionare il volume totale delle cellule in una provetta da 1,5 mL e aggiungere fino a 1 mL di DMEM/F12.
NOTA: È necessario utilizzare un volume che consenta alcune iniezioni extra per tenere conto delle perdite/errori di pipettaggio. - Metti le celle nel ghiaccio mentre vengono preparati i passaggi successivi.
- Dopo lo scongelamento, diluire la matrice della membrana basale solubilizzata a una concentrazione finale di 3 mg/mL in DMEM/F12 ghiacciato.
- Prelevare la sospensione a cella singola dal ghiaccio e farla girare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: Se non è disponibile una centrifuga refrigerata, la centrifuga a temperatura ambiente sembra generalmente tollerata. - Rimuovere delicatamente il fluido completamente senza disturbare il pellet della cella. Risospendere il pellet cellulare mediante pipettaggio delicato nella matrice della membrana basale solubilizzata diluita (3 mg/mL) per ottenere un volume finale di 2 μL per iniezione da eseguire, e rimetterlo immediatamente su ghiaccio fino all'uso.
NOTA: La risospensione delle cellule deve essere eseguita lentamente e con punte preraffreddate per evitare la formazione di bolle e gelificazione. - Trasferire la/e siringa/e pre-raffreddata/e dal congelatore a -20 °C in un secchiello per il ghiaccio. Tienili lì fino al momento dell'uso.
- Rimuovere la piastra con gli organoidi cerebrali dall'incubatrice. Utilizzare una punta a foro largo per trasferire l'organoide da iniettare in un piatto da 35 mm. Rimuovere tutto il mezzo possibile senza danneggiare l'organoide per stabilizzarlo e facilitare l'iniezione.
NOTA: È importante utilizzare punte a foro largo per evitare di distruggere l'organoide. Se non sono disponibili, tagliare l'estremità di una normale punta P1.000 con forbici sterili. - Posizionare la piastra da 35 mm contenente l'organoide sotto un microscopio da dissezione per aiutare a guidare e facilitare l'iniezione.
NOTA: Se non è disponibile un microscopio da dissezione in un'area sterile, è possibile eseguire l'iniezione senza uno, anche se con un controllo leggermente ridotto. Un'altra alternativa è l'uso di un anello di ingrandimento o di occhiali. - Una volta che l'organoide o gli organoidi sono pronti per essere iniettati, risospendere delicatamente le cellule con un puntale per pipetta P20 raffreddato e spostare 2 μl (contenenti il numero desiderato di cellule da iniettare) su un vetrino sterile preraffreddato.
NOTA: Per iniezioni multiple, è possibile aggiungere un volume aggiuntivo di 2 μl attraverso il vetrino. Tienilo in ghiaccio e fai attenzione a evitare l'evaporazione. - Prelevare una siringa da insulina preraffreddata dal ghiaccio e aspirare lentamente i 2 μL di sospensione cellulare con lo smusso dell'ago rivolto verso il basso per consentire l'assorbimento di tutte le cellule/terreno.
NOTA: Assicurarsi di procedere molto lentamente per evitare di aspirare aria. - Aprire il coperchio del piatto contenente l'organoide e puntare il microscopio su di esso. Tenere il piatto con una mano. Posizionare lo smusso dell'ago verso l'alto e, con l'altra mano, iniettare lentamente le cellule nella superficie dell'organoide.
NOTA: È importante iniettare lentamente per evitare di danneggiare il tessuto. - Dopo l'iniezione, rimettere il coperchio nel piatto e lasciare riposare l'organoide iniettato per 1-2 min.
NOTA: Ciò consente alla matrice della membrana basale diluita e solubilizzata di gelificare, mantenendo le cellule in posizione. Se il terreno viene aggiunto troppo presto, può lavare via le cellule che si trovano in superficie. - Aggiungere delicatamente 500 μl del terreno dell'organoide e trasferire l'organoide con una punta a foro largo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Incubare l'organoide a 37 °C e 5% di CO2 per una notte. Eseguire le modifiche complete del terreno ogni due giorni.
NOTA: È importante includere un organoide di controllo negativo (iniettato simulatamente), che verrà utilizzato per le regolazioni dell'imaging. Per fare ciò, iniettare un organoide come precedentemente descritto con una matrice di membrana basale solubilizzata diluita (3 mg/mL) per ottenere un volume finale di 2 μL senza cellule.