Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Sommario

Questo protocollo video viene illustrato il metodo di analisi per generare neurosfere ed espandere le cellule staminali neurali adulte provenienti dalla regione periventricolare del mouse, e fornisce approfondimenti tecnici per garantire la si può raggiungere culture neurosfere riproducibile.

Abstract

L'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali putativo (NSC) dal cervello adulto murino è stato descritto da Reynolds e Weiss nel 1992 utilizzando una chimica definita senza siero sistema di coltura noto come il test neurosfere (NSA). In questo saggio, la maggior parte dei tipi di cellule differenziate morire entro pochi giorni di cultura, ma una piccola popolazione di cellule precursori fattore di crescita sensibili sottoposti attiva proliferazione in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e / base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Queste cellule formano colonie di cellule indifferenziate chiamate neurosfere, che a sua volta può essere reinoculate per espandere il pool di cellule staminali neurali. Inoltre, le cellule possono essere indotte a differenziarsi, generando le tre principali tipi di cellule del sistema nervoso centrale cioè neuroni, astrociti e oligodendrociti. Questo test fornisce un prezioso strumento per fornire una costante, fonte rinnovabile di precursori indifferenziati sistema nervoso centrale, che potrebbero essere utilizzati per studi in vitro e anche per scopi terapeutici.

Questo video viene illustrato il metodo NSA per generare ed espandere NSCs dalla regione periventricolare topo adulto, e fornisce approfondimenti tecnici per garantire la si può raggiungere culture neurosfere riproducibile. La procedura prevede la raccolta del cervello da topo adulto, micro-dissezione della regione periventricolare, preparazione dei tessuti e della cultura nella NSA. Il tessuto raccolto viene prima digerito chimicamente con tripsina-EDTA e poi dissociato meccanicamente in NSC medio per ottenere una sospensione singola cellula e, infine, placcato in NSA. Dopo 7-10 giorni in coltura, la risultante neurosfere primarie sono pronti per la sottocultura di raggiungere la quantità di cellule necessario per gli esperimenti futuri.

Protocollo

Parte 1: impostare prima di procedere alla dissezione:

1. Volume appropriato di completo supporto NSC è preparata mescolando NeuroCult medio basale NSC e NeuroCult NSC Supplementi proliferazione con un rapporto 9:1, rispettivamente. NSC medio può essere fatta anche in laboratorio in base alla composizione mezzo di crescita NSC pubblicato nella letteratura ¹. Se il laboratorio non ha molta esperienza con fare media, si consiglia di utilizzare media disponibili in commercio che è stato per la crescita di qualità controllata NSC prima di essere venduto (che è il caso di NeuroCult, Technolgies cellule staminali).
2. Il mezzo è riscaldato in un bag....

Discussione

Il test neurosfere ² ha guadagnato l'attenzione generale della comunità di ricerca non solo per l'isolamento e lo studio di NSCs da SNC ^4-5, ma anche per l'isolamento di altri tipi di cellule staminali provenienti da tessuti diversi putativo, come il petto ⁶ e ⁷ e cuore per l'identificazione del cervello, della mammella e del colon cellule staminali tumorali ^8-9 suggerendo che questo sistema di coltura può essere applicato a una serie di somatiche e .......

Materiali

* Per rendere HEM, mescolare 110L pacchetto di MEM and160ml di HEPES 1M e portare il volume a 8,75 L con acqua distillata. Impostare il PH finale a 7,4 e conservarlo a 4 ° C.