Isolamento fotodegradabile a base di idrogel di colonie batteriche in array di micropozzetti

Abstract

Fonte: Fattahi, N., et al. Interfacce idrogel fotodegradabili per lo screening, la selezione e l'isolamento dei batteri. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra l'uso di idrogel fotodegradabili per isolare le colonie batteriche all'interno di array di micropozzetti di silicio. Le cellule batteriche vengono prima caricate in micropozzetti, incapsulate in un idrogel reticolato e coltivate in colonie distinte. Dopo l'esposizione alla luce ultravioletta, la degradazione mirata dell'idrogel consente l'estrazione selettiva delle singole colonie.

Protocollo

1. Ceppi batterici e protocolli di coltura

1. Striare colonie di batteri su piastre di agar integrate con terreni di crescita appropriati. In questo rapporto, Bacillus subtilis (ceppo 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) viene coltivato su ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄·H₂O, 0,125 M FeSO_4·7H₂O, 28 mM di glucosio, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L di agar) piastre di agar integrate con 100 μg/mL di spectinomicina ed Escherichia coli (ceppo 25922, ATCC) su piastre di agar ATGN integrate con 100 μg/mL di ampicillina.
   NOTA: Precedenti segnalazioni di incapsulamento e rilascio di idrogel con questi materiali hanno invece utilizzato cellule C58 di A. tumefaciens
2. Prelevare le colonie desiderate dalle piastre di agar ATGN e iniziare le colture notturne. Per i ceppi di E. coli e B. subtilis qui utilizzati, coltura a 37 °C agitando a 215 giri/min in terreno liquido ATGN per 24 ore. Conservare le colture cellulari in glicerolo al 50% a -80 °C fino a un futuro utilizzo.
3. Prelevare le colonie di entrambi i ceppi da ceppi di glicerolo utilizzando anse di inoculazione sterili e incubare in terreno liquido ATGN per 24 ore a 37 °C e 215 giri/min.

2. Preparazione del materiale necessario per la formazione dell'idrogel

1. NOTA: La sintesi interna del PEG-o-NB-diacrilato è stata ben descritta e precedentemente riportata. In alternativa, poiché la sintesi è di routine, può essere esternalizzata da un impianto di sintesi chimica.
2. Buffer reticolante
   1. Prendi la ricetta del terreno selezionato per il ceppo batterico e prepara il terreno con 2x nutrienti. Aggiungere fosfato, ad es. NaH₂PO_4, al mezzo fino a una concentrazione finale di 100 mM. Quindi, regolare il valore del pH su 8 utilizzando 5 M NaOH (aq).
   2. Sterilizzare la soluzione tampone e conservarla a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: Omettere eventuali metalli di transizione presenti nel mezzo, poiché questi metalli catalizzano l'ossidazione dei tioli a disolfuri.
3. Soluzione di diacrilato PEG-o-NB
   1. Per ogni mg di polvere aliquotata di diacrilato PEG-o-NB (peso molecolare 3,400 Da), aggiungere 3,08 μL di acqua ultrapura per raggiungere una concentrazione di 49 mM di PEG-o-NB-diacrilato (concentrazione di acrilato 98 mM).
   2. Agitare la soluzione fino a quando non è ben miscelata e conservare questa soluzione a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
Soluzione
4. di PEG-tiolo a 4 bracci
   1. Per la preparazione di PEG-tiolo a 4 bracci (peso molecolare 10.000 Da), aggiungere 4 μL di acqua ultrapura per mg di polvere per raggiungere una concentrazione di 20 mM (80 mM di concentrazione di tiolo).
   2. Agitare questa soluzione fino a quando non è ben miscelata e conservarla a -20 °C fino a nuovo utilizzo.

5. Fabbricazione di array di micropozzetti di silicio Rivestimento

in

1. parylene: utilizzare il protocollo standard descritto in precedenti articoli di ricerca per rivestire i wafer di silicio con parylene.
2. Microfabbricazione: Seguire il protocollo descritto in letteratura per progettare e fabbricare l'array di micropozzetti (Figura 1).
   NOTA: Sono state applicate tecniche fotolitografiche standard per fabbricare array di micropozzetti su wafer di silicio rivestiti di parylene.

7. Formazione di idrogel su array di micropozzetti

1. Semina dei batteri in array di micropozzetti
   NOTA: 700 μL di sospensioni cellulari da 0,1 OD₆₀₀ (densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nm) sono stati seminati sui substrati dell'array di micropozzetti ed è stato applicato il metodo di sollevamento del parylene per rimuovere le cellule dallo sfondo.
2. Preparare la soluzione precursore dell'idrogel aggiungendo 5,6 μl di PEG-o-NB-diacrilato con 12,5 μl di soluzione salina tamponata con fosfato a pH 8 ATGN e miscelando con 6,9 μl della soluzione tiolica PEG a quattro bracci.
3. Pipettare 12,5 μl della soluzione precursore su un vetrino perfluoroalchilato non reattivo e posizionare due distanziatori in acciaio da 38 μm (vedere la tabella dei materiali) su due lati opposti del substrato dell'array di micropozzetti inoculato con cellule.
4. Capovolgere il vetrino perfluoroalchilato con la gocciolina della soluzione precursore e posizionare la gocciolina al centro del substrato del micropozzetto. Quindi, incubare per 25 minuti a temperatura ambiente (RT) per la formazione di idrogel.
5. Rimuovere delicatamente il vetrino dal substrato del micropozzetto. La membrana dell'idrogel deve rimanere attaccata al substrato del micropozzetto.

Risultati

Figura 1: Progettazione e fabbricazione di array di micropozzetti. (A) Sono state applicate tecniche di microfabbricazione standard per fabbricare array di micropozzetti su wafer di silicio. (B) Ogni subs...

Materiali