Separazione delle frazioni di membrana interna ed esterna di batteri Gram-negativi

Abstract

Fonte: Cian, M. B. et. al., Separazione dell'involucro cellulare per batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interna ed esterna con aggiustamenti tecnici per Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la separazione delle frazioni di membrana interna ed esterna dei batteri Gram-negativi utilizzando l'ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Le frazioni di membrana vengono purificate e conservate a basse temperature per un'analisi mirata dei componenti specifici della membrana.

Protocol

1. Reagenti generali e preparazione dei terreni per l'estrazione su membrana

1. Terreni di crescita batterici: Preparare e sterilizzare 1 L di terreno di brodo in un pallone da 2 L accuratamente pulito e sterilizzato in autoclave.
2. Tampone di risospensione generale (1 M di tampone tris(idrossimetil)amminometano (Tris Buffer) pH 7,5; 50 mL): Sciogliere 6,05 g di Tris base in 30 mL di H₂O. Regolare il pH a 7,5 con 5 M HCl. Regolare il volume finale a 50 mL con H₂O ultrapuro.
3. Master stock di soluzione chelante cationica bivalente (acido etilendiammina tetraacetico 0,5 M, EDTA pH 8; 100 mL): aggiungere 18,6 g di etilene tetraacetato disodico·2H₂O a 80 mL di H₂O. Agitare energicamente e regolare il pH a 8,0 con idrossido di sodio (NaOH). Regolare il volume finale a 100 mL con H₂ultrapuro O.
   NOTA: Il sale disodico dell'EDTA non si dissolverà fino a quando il pH della soluzione non sarà regolato a ~8,0 mediante l'aggiunta di NaOH.
4. Tampone osmotico A (0,5 M saccarosio, 10 mM Tris pH 7,5; 1 L): Pesare 171,15 g di saccarosio e trasferirlo in un cilindro da 1 L. Aggiungere 10 mL di 1 M Tris pH 7,5. Regolare a un volume finale di 1 L con H₂O. ultrapuro. Conservare a 4 °C.
5. Lisozima (10 mg/mL; 5 mL): Pesare 50 mg di lisozima (albume d'uovo di gallina) e scioglierlo in 5 mL di H₂O. Conservare a 4 °C.
6. Soluzione chelante cationica bivalente diluita (1,5 mM EDTA; 500 mL): aggiungere 1,5 mL di 0,5 mL di EDTA 0,5 M (Step 1.3) a 497,5 mL di H₂O. Conservare a 4 °C.
7. Tampone osmotico B (0,2 M saccarosio, 10 mM Tris pH 7,5; 2 L): Pesare 136,8 g di saccarosio e trasferirlo in un cilindro da 2 L. Aggiungere 20 mL di 1 M Tris pH 7,5. Regolare il volume finale a 2 L con H₂O. ultrapuro. Conservare a 4 °C.
8. Cofattore nucleasi (1 M cloruro di magnesio, MgCl₂; 10 mL): Sciogliere 2,03 g di MgCl₂·6H₂O in 8 mL di H₂O ultrapuro. Regolare il volume a 10 mL. Conservare a temperatura ambiente.
9. Cocktail di soluzioni di nucleasi che include enzimi RNasi e DNasi: vedere la tabella dei materiali. Conservare a -20 °C.
10. Cocktail di inibitori della proteasi: vedere la tabella dei materiali. Conservare a 4 °C.
11. Soluzione isopicnica a gradiente di saccarosio a bassa densità (20% p/v di saccarosio, 1 mM di EDTA, 1 mM di soluzione Tris pH 7,5; 100 mL): pesare 20 g di saccarosio e trasferirlo in un cilindro da 200 mL. Aggiungere 100 μl di tampone Tris 1 M pH 7,5 e 200 μl di EDTA 0,5 M pH 8. Regolare il volume finale a 100 mL con H₂O ultrapuro. Conservare a temperatura ambiente.
12. Soluzione isopicnica a gradiente di saccarosio a media densità (53% p/v di saccarosio, 1 mM EDTA, 1 mM di soluzione Tris pH 7,5; 100 mL): Pesare 53 g di saccarosio e trasferire in un cilindro graduato da 200 mL. Aggiungere 100 μl di tampone Tris 1 M pH 7,5 e 200 μl di EDTA 0,5 M pH 8. Regolare il volume finale a 100 mL con H₂O ultrapuro. Conservare a temperatura ambiente.
    NOTA: Preparare questa soluzione in un cilindro graduato per garantire l'accuratezza dovuta all'alta percentuale di saccarosio. Aggiungere un'ancoretta magnetica e mescolare fino a quando il saccarosio non si sarà completamente sciolto nella soluzione. Questo processo può richiedere diverse ore.
13. Soluzione isopicnica a gradiente di saccarosio ad alta densità (73% p/v saccarosio, 1 mM EDTA, 1 mM Soluzione Tris pH 7.5; 100 mL): Pesare 73 g di saccarosio e trasferire in un cilindro graduato da 200 mL. Aggiungere 100 μl di tampone Tris 1 M pH 7,5 e 200 μl di EDTA 0,5 M pH 8. Regolare il volume finale a 100 mL con H₂O ultrapuro. Conservare a temperatura ambiente.
    NOTA: Preparare questa soluzione in un cilindro graduato per garantire l'accuratezza dovuta all'alta percentuale di saccarosio. Aggiungere un'ancoretta magnetica e mescolare fino a quando il saccarosio non si sarà completamente sciolto. Questo processo può richiedere diverse ore.
14. Tampone per la conservazione a membrana isolata (10 mM Tris Buffer pH 7,5; 1 L): aggiungere 1 mL di 1 M Tris Buffer pH 7,5 a un pallone da 1 L e regolare il volume finale a 1 L con H₂O ultrapuro.

2. Preparazione dei batteri per l'estrazione su membrana

1. Striare i batteri dalle scorte di glicerolo congelate su piastre di agar fresche. Conservare le piastre a 4 °C una volta che le colonie si sono sviluppate. Inoculare una singola colonia in una provetta da 5 ml riempita con terreno di coltura e coltivare i batteri come desiderato durante la notte.
2. Diluire la coltura batterica durante la notte in 1 litro di terreno di coltura preferito e coltivare i batteri fino a raggiungere la densità ottica desiderata.
   NOTA: L'inoculazione di una singola colonia batterica in 1 litro di terreno di coltura è consigliata per i genotipi mutanti che tendono a sopprimere i fenotipi di crescita, ma alcuni batteri Gram-negativi crescono semplicemente più lentamente di altri. Se non è possibile ottenere una densità di coltura sufficiente mediante inoculazione di una singola colonia, la retrodiluizione di una coltura notturna in 1 L di terreno è una strategia per sincronizzare la crescita. La composizione della membrana batterica varia a seconda della fase di crescita della coltura (fase logaritmica vs fase stazionaria). Le curve di crescita che misurano la variazione della densità ottica per le colture batteriche in funzione del tempo devono essere eseguite con tutti i ceppi per correlare la densità della coltura con la fase di crescita.
3. Mettere le fiasche contenenti i fermenti lattici in brodo sul ghiaccio. Leggere la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) e calcolare il volume di coltura che equivale a 6,0 e 8,0 x 10¹¹ unità formanti colonie batteriche (CFU). Per S. Typhimurium, ciò corrisponde a 1 L di coltura con un OD₆₀₀ compreso tra 0,6 e 0,8, poiché un OD600 di 1,0 è uguale a circa 1,0x10⁹ CFU/mL. Aggiungere questo volume in una provetta da centrifuga e assicurarsi che le colture rimanenti rimangano sul ghiaccio fino al momento di essere utilizzate.
4. Pellettare i batteri mediante centrifugazione a 4 °C a 7.000-10.000 x g in una centrifuga ad alta velocità ad angolo fisso per 10 min.
   NOTA: Preraffreddare e mantenere le centrifughe a bassa temperatura. Mantenere i campioni su ghiaccio durante l'intera procedura.
5. Decantare e scartare il surnatante con cura.
   NOTA: Se le frazioni della membrana non devono essere estratte immediatamente, il pellet può essere congelato e/o conservato a -80 °C. Tuttavia, si consiglia di procedere direttamente con la plasmolisi lo stesso giorno in cui vengono raccolte le cellule, soprattutto per le specie non enterobatteriche.

3. Dissociazione della membrana esterna e plasmolisi

1. Scongelare i pellet cellulari su ghiaccio se sono stati precedentemente conservati a -80 °C e conservare i campioni su ghiaccio per il resto della procedura. Risospendere ogni pellet di cellula all'interno della provetta da centrifuga in 12,5 mL di tampone A. Aggiungere un'ancoretta magnetica alla sospensione delle cellule.
2. Aggiungere 180 μL di lisozima 10 mg/mL (concentrazione finale di 144 μg/mL) a ciascuna risospensione cellulare. Tenere i campioni in ghiaccio mescolando per 2 minuti.
3. Aggiungere 12,5 mL di soluzione EDTA 1,5 mM a ciascuna risospensione cellulare e continuare a mescolare con ghiaccio per altri 7 minuti.
4. Decantare la sospensione in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 9.000-11.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
5. Gettare i surnatanti in un contenitore per rifiuti a rischio biologico e conservare i pellet sul ghiaccio.
6. Aggiungere 25 mL di tampone B al pellet cellulare.
7. Aggiungere 55 μL di 1 M di MgCl₂, 1 μL di reagente RNasi/DNasi nucleasi (per evitare problemi di viscosità associati ai batteri sottoposti a plasmolisi prima dell'omogeneizzazione) e 1 μL di cocktail di inibitori della proteasi al volume del tampone B che si trova sopra il pellet cellulare
8. Risospendere il pellet nella miscela di tampone B. Pipettare energicamente e agitare fino a quando non si osserva una soluzione omogenea.
   NOTA: È molto importante avere una soluzione omogenea prima di procedere alla fase 4 di questo protocollo. Le cellule risospese dovrebbero avere un aspetto viscoso simile a una pastella per torte.
9. Agitare ogni campione per 15 s. Conservare le sospensioni sul ghiaccio e procedere alla fase 4.

4. Omogeneizzazione e lisi pressurizzata
NOTA: Diversi metodi possono essere utilizzati per la lisi. La sonicazione non è l'ideale a causa della generazione di calore. La lisi osmotica può essere raggiunta, ma spesso è inefficiente. Pertanto, si consiglia la lisi ad alta pressione. La lisi ad alta pressione può essere ottenuta utilizzando una varietà di strumenti. Suggeriamo macchine per l'omogeneizzazione, come la French Press o la Emusliflex. Lavoriamo con molti tipi di batteri Gram-negativi la cui risposta alle soluzioni di saccarosio ad alta osmolare varia. La fase di omogeneizzazione ad alta pressione migliora l'efficienza, la riproducibilità e la resa.

1. Preraffreddare la cella French Press a 4 °C o inserire la bobina metallica dell'omogeneizzatore sul ghiaccio.
2. Versare il campione nella cella a pressione francese o nel cilindro dell'omogeneizzatore e portare la cella alla pressione di omogeneizzazione desiderata (10.000 psi dovrebbero essere sufficienti quando si utilizza una pressa francese o 20.000 psi quando si utilizza un omogeneizzatore).
3. Regolare la portata di uscita a circa una goccia al secondo mantenendo la pressione se si utilizza una pressa francese.
4. Raccogliere il lisato cellulare in provette coniche da 50 mL mantenendo i campioni in ghiaccio.
5. Ripetere i passaggi 4.2-4.4 da tre a cinque volte per ottenere una lisi completa, che in genere è indicata da un aumento graduale della trasparenza del campione.
   NOTA: La camera del campione deve essere lavata ed equilibrata con il tampone B tra un campione e l'altro.
6. Conservare le cellule lisate sul ghiaccio.

5. Frazionamento totale a membrana

1. Centrifugare i campioni batterici lisati a 6.169 x g per 10 minuti a 4 °C per pellettare il materiale cellulare intatto rimanente. (ad esempio, cellule batteriche non lisate).
2. Distribuire la parte rimanente del surnatante, che ora contiene le membrane omogeneizzate, in un flacone di policarbonato per l'ultracentrifugazione.
   ATTENZIONE: Se necessario, i campioni cellulari possono essere bilanciati diluendo con il tampone B.
3. Ultracentrifugare i lisati cellulari a 184.500 x g per almeno 1 ora, a 4 °C. Questo passaggio può essere eseguito durante la notte senza compromettere la qualità delle membrane.
4. Scartare il surnatante rimanente presente nella provetta dell'ultracentrifuga e trattenere i pellet della membrana sul ghiaccio (Figura 1).
5. Risospendere i pellet di membrana in 1 mL della soluzione a gradiente isopicnico-saccarosio a bassa densità utilizzando un omogeneizzatore glass-Dounce. Trasferire l'omogeneizzato del campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una pipetta di vetro Pasteur e conservarlo con ghiaccio.
   NOTA: Se si desidera solo l'analisi della composizione totale della membrana, sostituire 1 mL di soluzione a gradiente isopicnico-saccarosio a bassa densità con 1 mL di tampone di conservazione a membrana isolata. La fase 5.5 è l'endpoint dell'isolamento se si desidera solo campioni totali di membrana batterica. Conservare i campioni a -20 °C fino a quando non sono necessarie ulteriori analisi a valle.

6. Ultracentrifugazione a gradiente di densità per separare le doppie membrane

1. Raccogliere il numero appropriato di provette da 13 mL in polipropilene o ultratrasparenti a parte superiore, specificate per un rotore a secchiello oscillante e un'ultracentrifuga.
2. Tenere la provetta in una posizione leggermente inclinata e preparare il gradiente di saccarosio aggiungendo lentamente soluzioni di saccarosio da una densità più alta a una densità più bassa nel seguente ordine: 2 mL di saccarosio al 73% p/v, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,54 mL di 53% p/v saccarosio, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
   1. Next, aggiungere la frazione totale di membrana (1 mL), che è stata risospesa nella soluzione di saccarosio al 20% p/v (fase 5.5). Evitare di mescolare la frazione di membrana con la soluzione di saccarosio che si trova sotto di essa. Le divisioni dovrebbero essere visibili tra ciascuno di questi strati.
   2. Infine, riempire la provetta con la soluzione a gradiente isopicnico-saccarosio a bassa densità (circa 6 mL). I tubi aperti in polipropilene e ultratrasparenti devono essere riempiti il più possibile (a 2 o 3 mm dalla parte superiore del tubo) per il supporto del tubo.
3. Regolazione per Acinetobacter baumannii 17978
   1. Adatta un gradiente di saccarosio regolato per l'uso con diversi campioni batterici. Per A. baumannii, il seguente gradiente di saccarosio ha permesso una separazione più completa delle membrane (Figura 2).2 mL di saccarosio al 73% p/v, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,54 mL di 45% p/v saccarosio, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
   2. Quindi, aggiungere la frazione totale di membrana (1 mL), che è stata risospesa nella soluzione di saccarosio al 20% p/v (passaggio 5.5). Evitare di mescolare la frazione di membrana con la soluzione di saccarosio che si trova sotto di essa. Le divisioni dovrebbero essere visibili tra ciascuno di questi strati.
   3. Infine, riempire la provetta con una soluzione a gradiente isopicnico-saccarosio a bassa densità (circa 6 mL). I tubi aperti in polipropilene e ultratrasparenti devono essere riempiti il più possibile (a 2 o 3 mm dalla parte superiore del tubo) per il supporto del tubo.
4. Ultracentrifugare i campioni utilizzando un rotore a secchiello oscillante a 288.000 x g e 4 °C durante la notte.
   NOTA: Per i volumi utilizzati nelle fasi precedenti, si consigliano tempi di centrifugazione compresi tra 16 e 23 ore.
5. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta P1000 a circa 5 mm dalla punta. Utilizzando la pipetta, rimuovere lo strato superiore marrone della membrana interna (IM). Trasferire la frazione IM in un flacone di policarbonato per ultracentrifugazione.
6. Lasciare circa 2 mL della soluzione di saccarosio al di sopra dell'interfaccia 53-73% per garantire che la membrana esterna bianca inferiore (OM) non sia contaminata in modo incrociato con la frazione IM. Ripetere la procedura di pipettaggio dal passaggio 6.4 per la frazione OM (Figura 1).
   NOTA: Le membrane possono essere raccolte anche perforando le provette da centrifuga sul fondo con un ago e raccogliendole come frazioni a goccia.
7. Riempire il vuoto rimanente della provetta per ultracentrifuga con un tampone di stoccaggio a membrana isolata e miscelare mediante inversione o pipettaggio. Conservare i campioni sul ghiaccio.
8. Raccogliere le membrane ora lavate e isolate mediante ultracentrifugazione a 184.500 x g per 1 ora a 4 °C.
9. Scartare il surnatante e risospendere le membrane mediante omogeneizzazione Dounce. Aggiungere 500-1000 μl di tampone di conservazione. Raccogliere i campioni in provette per microcentrifuga da 2 mL.
10. Conservare i campioni di membrana batterica a -20 °C.

Results

Figura 1: Uno schema che descrive la procedura di isolamento della membrana batterica Gram-negativa descritta in questo articolo sui metodi. Viene mostrata la procedura utilizzata per raccogliere le cellule batteriche e isolare le membrane totali, interne...

Materials