Visualizzazione delle vescicole extracellulari cianobatteriche mediante microscopia elettronica a trasmissione

Abstract

Fonte: Biller, S. J., et al. Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari cianobatteriche. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra la preparazione di vescicole extracellulari cianobatteriche per la microscopia elettronica a trasmissione mediante colorazione negativa, consentendo la visualizzazione ad alta risoluzione della morfologia, delle dimensioni e della purezza delle vescicole per analisi strutturali e comparative.

Protocollo

1. Caratterizzazione delle vescicole isolate Eseguire la

1. microscopia elettronica a trasmissione di macchie negative (vedi Tabella dei materiali) (TEM - microscopia elettronica a trasmissione; dimensione delle particelle, struttura, purezza).
   1. Per migliorare la qualità dell'immagine, scaricare la superficie di una griglia TEM precedentemente rivestita utilizzando un sistema di scarica a bagliore secondo le linee guida del produttore (vedere la tabella dei materiali).
   2. Applicare con cautela ~5 μL del campione di vescicola e lasciare riposare per 5 min.
      >NOTA: I campioni con concentrazioni di vescicole >10^{9 mL-1} daranno in genere i migliori risultati; i campioni più diluiti avranno poche vescicole per immagine.
   3. Rimuovere il campione toccando il bordo di una griglia con un pezzo di carta da filtro pulita.
   4. Pipettare una goccia da 20-50 μl di acetato di uranile al 2% (vedere la Tabella dei materiali) su una superficie piana coperta da una pellicola di plastica e posizionare la griglia galleggiante sopra di essa per 2 minuti.
   5. Rimuovere l'acetato di uranile utilizzando carta da filtro e far galleggiare brevemente su una goccia di acqua ultrapura per lavare. Ripetere il lavaggio con acqua una seconda volta.
      NOTA: La griglia di asciugatura finale è pronta per la visualizzazione dopo il passaggio 1.1.5.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2% Soluzione di acetato di uranile	Microscopia elettronica	22400-2	Colorazione negativa - Pellicola di
supporto in carbonio TEM 200 Mesh, rame. CF200-Cu	Microscopia elettronica Sciences	71150	Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
griglia easiGlow Glow Glow Discharge Cleaning System	Ted Pella	91000	Commercial TEM grid glow discharger
Sistema di purificazione dell'acqua di riferimento Milli-Q	Merck	Z00QSV0WW	Sistema di purificazione dell'acqua per ottenere acqua di grado ultrapuro di tipo I
Microscopio elettronico a trasmissione	JEOL	JEM-1400	O microscopio simile