Valutazione delle interazioni batteri-cellule ospiti utilizzando le perle biomimetiche

Abstract

Fonte: Stones, D. H., et al. Materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batterio-ospite. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra l'uso di perle batteriomimetiche per quantificare l'adesione batterica alle cellule epiteliali dell'ospite in condizioni competitive. Descrive le fasi coinvolte nel trattamento delle cellule, nella loro lisizzazione e nella piastrata delle diluizioni seriali per misurare le unità formanti colonie.

Protocollo

1. Misurazione dell'adesione batterica
   1. Ai punti temporali indicati (ad esempio, 1 ora dopo l'infezione), rimuovere il terreno dallo strato cellulare.
   2. Lavare accuratamente lo strato cellulare con soluzione salina sterile e preriscaldata tamponata con fosfato (PBS) (almeno 3-4 lavaggi da 1 ml di PBS ciascuno) per rimuovere eventuali cellule non attaccate.
   3. Lisi le cellule ospiti aggiungendo 1 ml di una soluzione sterile di Triton X-100 all'1 % v/v in PBS per pozzetto. Incubare la piastra a 37 °C per 5 minuti.
   4. Pipettare più volte ogni campione su e giù prima di trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in provette separate da 1,5 ml. Preparare diluizioni seriali di 10 volte i campioni in PBS sterile (ad esempio, utilizzare 100 ml di campione e 900 ml di PBS).
   5. Piastra 100 μl di ciascun campione su agar marino Luria-Bertani (MLB) e stendere utilizzando uno spandiconcime cellulare. Ottimizzare le diluizioni da impiattare a seconda dei ceppi batterici e del punto temporale.
      Nota: Per la configurazione sperimentale descritta, 10^{diluizioni da 5} o^{10 da 6} volte forniscono un numero adeguato di unità formanti colonie (CFU).
   6. Incubare le piastre a 37 °C O/N ed enumerare i batteri mediante conteggio delle colonie.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagents
Perle di polistirene modificate con carbossilato	Sigma	CLB9	dannoso; è disponibile
una gamma di dimensioni e colori alternativi delle particelleDulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose - Con 4500 mg/L di glucosio e bicarbonato di sodio, senza L-glutammina, piruvato di sodio e rosso fenolo, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari	Sigma	D1145	per esperimenti di infezione
DMEM	Sigma	D6429	per il mantenimento di cellule ospiti
in coltura Siero fetale bovino, inattivato a caldo	Sigma	F9665	integratore per terreno di coltura tissutale
Penicillina-streptomicina -Soluzione stabilizzata, con 10.000 unità di penicillina e 10 mg di streptomicina/mL, filtrato sterile, BioReagente, adatto per colture cellulari	Sigma	F9665	integratore per terreno di coltura tissutale
PBS	Sigma	D8537
Plasticware
Piastre a 24 pozzetti	Greiner	662160
Apparecchiature
Impianti
Pipetta

per la coltura dei tessutimulticanale