1. Raccolta di campioni per l'estrazione con polifosfati
- Coltivare i batteri nelle condizioni di interesse per determinare il contenuto di poliP. Per questo protocollo, coltivare il Lactobacillus reuteri durante la notte a 37 °C senza agitare in terreno di induzione dell'enzima malico (MEI) senza cisteina (MEI-C).
- Raccogliere un numero sufficiente di cellule mediante centrifugazione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per un totale di 50-100 μg di proteine cellulari (vedere il passaggio 3 di seguito). Per E. coli, si tratta di 1 mL di coltura in fase logaritmica con un A600 di 0,2 - 0,4. Per L. reuteri, si tratta di 1 ml di coltura notturna. Regolare se necessario per altre specie di interesse.
- Rimuovere completamente il surnatante dai pellet cellulari.
- Risospendere i pellet cellulari in 250 μl di tampone di lisi GITC (isotiocianato di guanidina 4 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7) e lisare mediante incubazione a 95 °C per 10 minuti. Conservare i lisati a -80 °C.
NOTA: Rispettare il tempo di lisi, poiché un'incubazione prolungata ad alta temperatura può provocare la degradazione del poliP per idrolisi. I lisati possono essere conservati a tempo indeterminato a -80 °C.
ATTENZIONE: L'isotiocianato di guanidina è un sale caotropico e deve essere maneggiato con i guanti e smaltito come rifiuto pericoloso.
2. Misurazione del contenuto proteico dei lisati cellulari
- Preparare gli standard di albumina sierica bovina (BSA) contenenti 0, 0,1, 0,2 e 0,4 mg mL-1 di BSA nel tampone di lisi GITC.
NOTA: È importante stabilire gli standard BSA in GITC, poiché GITC influenza lo sviluppo del colore del test Bradford. Gli standard BSA possono essere conservati a tempo indeterminato a -20 °C. - Aliquotare 5 μl di lisati cellulari scongelati e ben miscelati e di standard BSA per separare i pozzetti in una piastra trasparente a 96 pozzetti.
- Aggiungere 195 μl di reagente Bradford a ciascun pozzetto e misurare l'assorbanza a 595 nm (A595) in un lettore di piastre (vedere la tabella dei materiali).
- Calcola la quantità di proteine in ciascun pozzetto rispetto alla curva standard BSA, utilizzando la formula y = mx + b, dove y è A595, x è μg di BSA, m è la pendenza della curva standard e b è l'intercetta y della curva standard. Moltiplicare il valore risultante per 0,05 per determinare il totale di mg di proteine in ciascun campione.
3. Estrazione del polifosfato
- Aggiungere 250 μl di etanolo al 95% a ciascun campione LITs GITC e frullare a vortice.
- Applicare la miscela su una colonna di centrifuga con membrana di silice e centrifugare per 30 s a 16.100 x g.
- Scartare il flusso, quindi aggiungere 750 μl di 5 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM di NaCl, 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), etanolo al 50% e centrifugare per 30 s a 16.100 x g.
- Scartare il flusso continuo e centrifugare per 2 minuti a 16.100 x g.
- Posizionare la colonna in una provetta per microfuge pulita da 1,5 mL e aggiungere 150 μL di Tris-HCl da 50 mM (pH 8).
- Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi eluire il polyP centrifugando per 2 minuti a 8.000 x g.
NOTA: Se lo si desidera, gli eluati possono essere conservati a -20 °C per almeno 1 settimana.
4. Digerire il polifosfato
- Preparare gli standard contenenti 0, 5, 50 o 200 μM di fosfato di potassio in 50 mM di Tris-HCl (pH 8).
NOTA: Gli standard di fosfato di potassio possono essere conservati a tempo indeterminato a temperatura ambiente. - Aliquotare 100 μl di ogni standard di fosfato e di campioni di poliP estratti in pozzetti separati di una piastra trasparente a 96 pozzetti.
- Preparare una miscela master contenente (per campione): 30 μl di 5 tamponi di reazione ScPPX (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM di acetato di ammonio, pH 7,5)13, 19 μl di H2O e 1 μl di ScPPX purificato (1 mg mL-1).
- Aggiungere 50 μl della miscela master a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Incubare per 15 minuti a 37 °C.
NOTA: Se lo si desidera, i campioni di poliP digeriti possono essere conservati a -20 °C a tempo indeterminato.
5. Rilevamento del fosfato libero
- Preparare la base della soluzione di rilevazione sciogliendo 0,185 g di tartrato di potassio antimonio in 200 mL di acqua, aggiungendo 150 mL di 4 N H2SO4, quindi aggiungendo 1,49 g di eptamolibdato di ammonio. Mescolare per sciogliere e poi portare a un volume finale di 456 mL. Filtrare la soluzione per rimuovere il particolato e conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Preparare una soluzione madre di acido ascorbico 1 M. Conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Preparare ogni giorno una nuova scorta di soluzione di rilevazione mescolando 9,12 mL di base della soluzione di rilevazione con 0,88 mL di acido ascorbico 1 M. Lasciare che la soluzione di rilevamento raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso.
- Aggiungere 50 μl di soluzione di rivelazione a ciascun campione e standard nella piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per circa 2 minuti per consentire lo sviluppo del colore.
- Misurare l'assorbanza a 882 nm con un lettore di piastre e calcolare la concentrazione di fosfato di ciascun campione confrontandola con la curva standard del fosfato di potassio.
ATTENZIONE: La soluzione di rilevazione contiene sali tossici e acidi forti. Indossare guanti e trattare la soluzione in eccesso come rifiuto tossico.
6. Calcolo del contenuto di polifosfato cellulare
- Convertire le concentrazioni di fosfato determinate al punto 5.5 in nanomoli di fosfato derivato da poliP in ciascun lisato cellulare intero secondo la seguente formula:
nmol polyP = 1,5 x (μM fosfato / 10)
NOTA: Il metodo standard basato su curve nel passaggio 5 determina la concentrazione di fosfato (in μM) in ogni campione di poliP da 100 μL aliquotato al passaggio 4.2. Per convertire questa concentrazione in un numero di nmol, 100 μl viene diviso per 106 per ottenere un volume in L, moltiplicato per la concentrazione (μmol L-1), quindi moltiplicato per 1.000 (il numero di nmol in un μmol). Questo si riduce a dividere la concentrazione per 10. Il volume totale dell'estratto preparato nella fase 3 è di 150 μL, quindi è necessario moltiplicare il valore risultante per 1,5 per calcolare l'nmol di fosfato presente nell'intero estratto. - Normalizzare il contenuto di poliP cellulare in proteina cellulare totale dividendo nmol polyP per il mg di proteina totale in ciascun campione, determinato al punto 1.4. I livelli di poliP sono espressi in termini di concentrazione del singolo fosfato libero derivato da poliP.
NOTA: In alcuni casi, la quantità di fosfato derivato da poliP presente in un campione può non rientrare nell'intervallo lineare della curva standard del fosfato. Se i livelli di poliP sono molto elevati, l'eluato contenente poliP in eccesso dal passaggio 3.6 può essere diluito 1:10 o 1:100, a seconda delle necessità, e quindi misurato nuovamente come descritto nei passaggi da 4 a 6.
