Un saggio per la quantificazione del polifosfato inorganico nei batteri

Abstract

Fonte: Pokhrel, A., et al. Dosaggio del polifosfato inorganico nei batteri. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra un test colorimetrico per misurare il polifosfato inorganico (polyP) in campioni batterici. La procedura prevede la conversione enzimatica del poliP in fosfato libero, che poi reagisce con il molibdato e l'acido ascorbico per produrre un complesso di colore blu. Confrontando l'assorbanza di questo complesso con una curva standard di concentrazioni note di fosfato, il contenuto di poliP nei campioni batterici può essere quantificato con precisione.

Protocollo

1. Raccolta di campioni per l'estrazione con polifosfati

1. Coltivare i batteri nelle condizioni di interesse per determinare il contenuto di poliP. Per questo protocollo, coltivare il Lactobacillus reuteri durante la notte a 37 °C senza agitare in terreno di induzione dell'enzima malico (MEI) senza cisteina (MEI-C).
2. Raccogliere un numero sufficiente di cellule mediante centrifugazione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per un totale di 50-100 μg di proteine cellulari (vedere il passaggio 3 di seguito). Per E. coli, si tratta di 1 mL di coltura in fase logaritmica con un A₆₀₀ di 0,2 - 0,4. Per L. reuteri, si tratta....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
E. coli BL21(DE3)	Millipore Sigma	69450
LB broth	Fisher Scientific	BP1427-2	E. coli crescita media
ampicillina	Fisher Scientific	BP176025
cloruro di sodio (NaCl)	Fisher Scientific	S27110
cloruro di magnesio (MgCl₂)	Fisher Scientific	BP214-500
reagente Bradford	Bio-Rad	5000205
tampone Tris	Scientific	BP1525
acido cloridrico (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	per la regolazione del pH delle soluzioni tamponate con Tris
cloruro di potassio (KCl)	Fisher Scientific	P217500
glicerolo	Fisher Scientific	BP2294
10x MOPS miscela media	Teknova	M2101	E. coli media
di crescita glucosio	Fisher Scientific	D161
fosfato di potassio monobasico (KH₂PO₄)	Fisher Scientific	BP362-500
fosfato di potassio bibasico (K₂HPO₄)	Fisher Scientific	BP363-500
estratto di lievito disidratato	Fisher Scientific	DF0886-17-0
triptone	Fisher Scientific	BP1421-500
solfato di magnesio eptaidrato	Fisher Scientific	M63-50
solfato di manganese monoidrato	Fisher Scientific	M113-500
isotiocianato di guanidina	Fisher Scientific	BP221-250
albumina sierica bovina (senza proteasi)	Fisher Scientific	BP9703100
piastre trasparenti a fondo piatto a 96 pozzetti	Sigma-Aldrich	M0812-100EA	qualsiasi La piastra trasparente a 96 pozzetti funzionerà Tecan
M1000 Lettore di piastre infinito	Tecan, Inc.	non applicabile	qualsiasi lettore di piastre in grado di misurare l'assorbanza a 595 e 882 nm funzionerà
etanolo	Fisher Scientific	04-355-451
colonne di centrifuga con membrana in silice	Epoch Life Science	1910-050/250
acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Fisher Scientific	BP120500
provette microfughe da 1,5 mL	Fisher Scientific
acetato di ammonio	Fisher Scientific	A637-500
tartrato di potassio antimonio	Fisher Scientific	AAA1088922
acido solforico 4 N (H₂SO₄)	Fisher Scientific	SA818-500
eptamolibdato di ammonio	Fisher Scientific	AAA1376630
acido ascorbico	Fisher Scientific	AC401471000

Fisher NC9580154