Saggio della replicazione di Legionella pneumophila nei macrofagi pretrattati con vescicole della membrana esterna

Abstract

Fonte: Jung, A. L. et. al., Vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila: isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra il pre-trattamento dei macrofagi con vescicole di membrana esterna (OMV) di Legionella pneumophila per esaminare il loro effetto sulla replicazione batterica. Alterando la segnalazione immunitaria dell'ospite, gli OMV rendono i macrofagi più permissivi all'infezione. Un numero più elevato di colonie nelle cellule trattate, rispetto a quelle non trattate, indica che gli OMV promuovono la replicazione di L. pneumophila all'interno dei macrofagi.

Protocollo

1. Pre-trattare i macrofagi

1. Preparare le cellule THP-1 (cellule del Tohoku Hospital Pediatrics-1, una linea cellulare di leucemia monocitica umana).
   NOTA: THP-1 è una linea cellulare monocitica derivata da un paziente affetto da leucemia.
   1. Aggiungere 2x10⁵ cellule THP-1 per 24 pozzetti e differenziarle aggiungendo 20 nM di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) in cellule simili ai macrofagi. Incubare per 24 ore a 37 °C.
   2. Sostituire il terreno con 500 μL di terreno fresco e incubare per altre 24 ore; il terreno ottimale per le cellule THP-1 è costituito dal Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale di vitello.
2. Isolare i macrofagi murini derivati dal midollo osseo (mBMDM).
3. Trattare i macrofagi derivati da THP-1 o mBMDM con vescicole di membrana esterna (OMV).
   1. Scongela gli OMV e aggiungili ai macrofagi umani o murini in base alla loro quantità di proteine (0,1, 1 e 10 μg/mL). Incubare i macrofagi con OMV a 37 °C per almeno 20 ore.

2. Infettare i macrofagi e valutare la replicazione batterica con un test dell'unità formante colonia (CFU)

1. Utilizzare Legionella pneumophila, cellule THP-1 pretrattate o mBMDM dal passaggio 4.3 e non macrofagi pretrattati come controlli (2x10⁵/24 pozzetti). Non sostituire il fluido.
2. Infettare le cellule THP-1 con L. pneumophila Corby WT e mBMDM con un mutante di L. pneumophila Corby privo di flagellina (entrambi con una molteplicità di infezione (MOI) di 0,5; 1x10⁵ L. pneumophila/24 pozzetti) e incubare per 24 e 48 ore, rispettivamente.
3. Lisare le cellule nel loro mezzo con l'aggiunta di saponina (concentrazione finale: 0,1%) e incubare a 37 °C per 5 minuti.
4. Risospendere i batteri mediante pipettaggio e trasferire la sospensione in un recipiente di reazione. Preparare diluizioni seriali del terreno contenente L. pneumophila in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
5. Striare 50 μl delle diluizioni richieste su piastre di agar con estratto di lievito di carbone tamponato (BCYE) e incubare per 3 giorni a 37 °C.
6. Conta visivamente le colonie formate. Calcola il CFU

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Normalizza il risultato del conteggio dei CFU ai macrofagi non pretrattati ma infetti, che sono impostati al 100%.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 cm petridish	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)	82.1473
Carbone attivo	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	5210.2
Columbia agar con il 5% di sangue di pecora	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germania)	254005
Nitrato ferrico nonaidrato	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	5632.1
Siero fetale di vitello (FCS)	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germania)	10270-106
Heracell 240i Incubatore ad anidride carbonica	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	75004515
Anello di inoculazione	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	Gentilmente fornito dal Prof. Dr Antje Flieger (RKI, Berlino, Germania)
L. pneumophila Corby ΔflaA	---	---	Gentilmente fornito dal Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlino, Germania)
mBMDM	---	---	Gentilmente fornito dal Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germania) e dal Prof Dr Carsten Kirschning (Università Duisburg Essen, Essen, Germania)
PBS	Biochrom GmbH (Berlino, Germania)	L 1825
Phorbol 12-miristate 13-acetato	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germania)	P8139-1MG
Agitatore rotante (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	SHKE6000
RPMI 1640 high glucose	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germania)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Inghilterra)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germania)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)
Estratto di lievito	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	2363.2