Una procedura per la raccolta batterica e la lisi meccanica

Abstract

Fonte: Mercier, N., et al. Purificazione di affinità MS2 abbinata al sequenziamento dell'RNA nei batteri Gram-positivi. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra una procedura passo-passo per la raccolta di cellule batteriche e la loro lisologia meccanica per rilasciare contenuti intracellulari.

Protocollo

1. Raccolta dei batteri

ATTENZIONE: Questa fase prevede la manipolazione di batteri patogeni.

1. Coltivare una colonia di ceppi portatori di plasmidi pCN51-P3-MS2-sRNA o pCN51-P3-MS2 in 3 mL di terreno di infusione cardiaca cerebrale (BHI) integrato con eritromicina (10 μg/μL) in duplicati.
2. Diluire ogni coltura notturna in 50 mL (≈1/100) di terreno BHI fresco integrato con eritromicina (10 μg/μL) per raggiungere un OD_600nm di 0,05. Utilizzare fiasche sterilizzate da 250 ml (rapporto 5:1 pallone/fluido).
   NOTA: Il terreno e le condizioni di crescita devono essere impostati in base al modello di espressione dell'sRNA studiato.
3. Coltivare le colture a 37°C con agitazione a 180 giri/min per 6 ore.
4. Trasferire ogni coltura in una provetta da centrifuga da 50 mL.
5. Centrifugare a 2.900 x g per 15 minuti a 4°C. Eliminare il surnatante.
6. Conservare i pellet sul ghiaccio ed eseguire direttamente la lisi meccanica delle celle o congelare e conservare i pellet a -80 °C.

2. Lisi cellulare meccanica

ATTENZIONE: I seguenti passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio e i tamponi devono essere a 4 °C. Utilizzare guanti e prendere tutte le precauzioni per proteggere i campioni dalle RNasi.

1. Risospendere i pellet (passo 1.6) in 5 mL di tampone A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT).
2. Trasferire le cellule risospese in provette da centrifuga da 15 mL con 3,5 g di perle di silice (0,1 mm).
3. Inserire le provette in uno strumento meccanico di lisi cellulare. Eseguire un ciclo di 40 s a 4,0 m/s.
   NOTA: Se un ciclo non è sufficiente per rompere le celle, lasciare raffreddare il dispositivo per 5 minuti mantenendo i campioni sul ghiaccio. Quindi, ripetere un altro ciclo di 40 s a 4,0 m/s. L'efficienza della lisi cellulare può essere testata placcando il surnatante su una piastra BHI-agar.
4. Centrifugare a 15.700 x g per 15 min. Recuperare il surnatante e mantenerlo in ghiaccio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
15 mL provette da centrifuga	Falcon	352070
Provette da centrifuga da 50 mL	Falcon	352051
250 mL pallone di coltura	Dominique Dutscher	2515074	Colture
BHI (Brain Heart Infusion) Brodo	Sigma-Aldrich	53286	Terreno di crescita
Eritromicina (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Terreno di crescita
Matrice di lisi B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Lisi meccanica
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Lisi meccanica
Dispositivo FastPrep	MP Biomedicals 116004500		Spettrofotometro a lisi meccanica
Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Colture batteriche

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