Isolamento di piccoli RNA bersaglio batterici regolatori legati all'RNA mediante purificazione per affinità

Abstract

Fonte: Mercier, N., et. al., MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra l'isolamento di un piccolo RNA regolatorio (sRNA) marcato con MS2 legato al suo RNA bersaglio batterico utilizzando la purificazione per affinità con una fusione di proteine di rivestimento MBP (Maltosio-binding protein) e MS2 immobilizzata su resina di amilosio.

Protocollo

Tamponi e terreni Per gli

esperimenti MAPS, preparare i seguenti tamponi e terreni:- Tampone A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)- Tampone E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltosio, 0,1% Triton, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)

Preparazione della colonna

ATTENZIONE: Fare attenzione a non lasciare asciugare la resina di amilosio. Se necessario, sigillare la colonna con un tappo terminale. Preparare tutte le soluzioni prima di iniziare la purificazione per affinità.

1. Mettere una colonna cromatografica in un rack per colonne.
2. Rimuovere la punta della colonna e lavare la colonna con acqua ultrapura.
3. Aggiungere 300 μl di resina di amilosio.
4. Lavare la colonna con 10 mL di Buffer A.
5. Diluire 1.200 pmol di proteina MBP (proteina legante il maltosio)-MS2 in 6 mL di tampone A e caricarlo nella colonna.
6. Lavare la colonna con 10 mL di Buffer A.

Purificazione di affinità MS2 (Figura 1)

1. Caricare il lisato cellulare nella colonna.
   NOTA: Conservare 1 mL di lisato cellulare (estratto grezzo, CE) per estrarre l'RNA totale ed eseguire il Northern blot e l'analisi trascrittomica.
2. Raccogliere la frazione a flusso continuo (FT) in una provetta di raccolta pulita.
3. Lavare la colonna 3 volte con 10 mL di tampone A. Raccogliere la frazione di lavaggio (W).
4. Eluire la colonna con 1 mL di Buffer E e raccogliere la frazione di eluizione (E) in una microprovetta da 2 mL.
5. Conservare tutte le frazioni raccolte in ghiaccio fino all'estrazione dell'RNA o congelarle a -20 °C per un uso successivo.

Risultati

Figura 1. Illustrazione schematica del protocollo MAPS adattato allo Staphylococcus aureus. Dalla costruzione dei plasmidi all'analisi dei dati.

Materiali