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1. Preparazione di ceppi batterici o librerie di mutanti
1. Strisciare i ceppi da testare su apposite piastre di agar. Queste sono piastre di serie per l'esperimento.
1. Incuba le piastre durante la notte alla temperatura desiderata per ottenere singole colonie. Per questo esperimento, coltivare K. pneumoniae (NTUH-K2044 e ceppi ATCC43816) su agar brodo Luria (LB) a 37 °C e S. pneumoniae (23F wild type e 23F Δcps) su agar sangue in un barattolo di candele umidificato a 37 °C.
2. Scegli una singola colonia da un piatto di riserva (passaggio 1.1) per inoculare 10 ml di brodo appropriato usando un anello sterile o un bastoncino da cocktail. Per lo screening di librerie di mutanti casuali, inoculare il brodo con 10 μL della libreria di mutanti casuali (Libreria TraDIS).
1. Incubare i ceppi di K. pneumoniae in terreni LB a basso contenuto di sale a 37 °C con agitazione, e i ceppi di S. pneumoniae in terreni di infusione cardiaca cerebrale (BHI), staticamente a 37 °C.
2. Trasferisci la coltura notturna in una provetta da 15 ml e centrifuga in una centrifuga da banco per 10 minuti a 3.200 x g in secchi oscillanti con inserti per provette da 15 ml e coperchi a tenuta di aerosol.
3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Smaltisci il surnatante attraverso l'apposito percorso di rifiuti biologici liquidi in laboratorio. Lo scopo delle fasi di centrifugazione e risospensione (1.2.2 e 1.2.3) è quello di concentrare i batteri per una facile visualizzazione sul gradiente. Le colture batteriche possono essere caricate direttamente sul gradiente, se si preferisce. I ceppi fortemente incapsulati potrebbero non formare un pellet stretto. In tal caso, rimuovere la maggior quantità possibile di surnatante senza rimuovere le cellule batteriche, aggiungere 1x PBS a un volume finale di 5 mL e risospendere il pellet. Continuare il protocollo con il passaggio 1.2.5.
5. Centrifuga le provette come descritto nel passaggio 1.2.2.
6. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 mL di 1x PBS. Le celle sono ora pronte per l'uso.
NOTA: La densità della sospensione cellulare batterica non è critica,l ma deve essere sufficiente per la visualizzazione nel gradiente. Si suggerisce un ODminimo di 600 (densità ottica a 600 nm) di 4.