Separazione dei batteri in base alla quantità di capsula utilizzando un gradiente di densità discontinuo

Abstract

Fonte: Feltwell, T., et.al. Separazione dei batteri in base alla quantità di capsula utilizzando un gradiente di densità discontinuo. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'uso di un gradiente di densità discontinuo per separare i ceppi batterici in base alla quantità di capsule. Centrifugando una libreria di mutanti trasposoni attraverso il gradiente, i batteri con diverse densità di capsule si localizzano in strati distinti. Le frazioni separate possono quindi essere raccolte per l'analisi a valle.

Protocollo

1. Aggiunta di cellule preparate ai gradienti e separazione per centrifugazione

1. Aggiungere 600 μl di cellule preparate alla parte superiore del gradiente nella provetta molto lentamente e senza mescolare l'interfaccia.
2. Posizionare le provette negli adattatori per provette e pesare gli adattatori e le provette combinate per assicurarsi che siano bilanciati.
   1. Posiziona gli adattatori delle provette in un rotore ad angolo fisso all'interno di una centrifuga da banco. Centrifugare per 30 min a 3.000 x g.
   2. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura le provette, posizionarle in una rastrelliera adatta e fotografare i risultati come registrazione.
3. Recuperare le frazioni batteriche per la quantificazione dell'acido uronico o l'estrazione del DNA.
   1. Se non sono necessarie applicazioni a valle, smaltire i campioni/gradienti attraverso l'apposito percorso di rifiuti biologici liquidi in laboratorio.
      NOTA: È importante convalidare la separazione per nuove specie/ceppi di batteri. Le singole frazioni del gradiente devono essere esaminate al microscopio, al dosaggio dell'acido uronico o in un altro test quantitativo adatto per confermare il fenotipo della capsula di ciascuna frazione. Se l'obiettivo è quello di separare in base all'aggregazione o alle dimensioni delle cellule, è necessario utilizzare saggi appropriati indipendenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Centrifuga 5810R con rotore A-4-81 e secchi da 500ml	Eppendorf	5810 718.007
Adattatori per provette da 15 ml	Eppendorf	5810 722.004
Rotore ad angolo fisso F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
Adattatore per provette da 2,6 - 7 ml	Eppendorf	5804 739.000
Centrifuge 5424 incluso Rotore FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
Provetta a fondo tondo in polipropilene da 5 ml	Falcon	352063