Acoustoporesi assistita da aptamero per la separazione microfluidica di batteri Gram-negativi

Abstract

Fonte: Choi, H. J., et al. Acoustoforesi microfluidica per la separazione a flusso di batteri Gram-negativi mediante perle di affinità aptamero. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra il metodo per separare selettivamente i batteri Gram-negativi da un campione batterico misto utilizzando microsfere rivestite di aptamero e forze acustiche all'interno di un chip microfluidico.

Protocollo

1. Installazione e funzionamento dell'acoustophoresis<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. Collegare le provette in polietereterchetone (PEEK) ai due ingressi per l'iniezione di due campioni e tampone e alle due uscite per la raccolta e lo scarico dei rifiuti (Figura 1).
3. Riempire manualmente il canale dell'acustoforesi microfluidica con acqua demineralizzata priva di bolle utilizzando una siringa da 10 ml.
4. Preparare un regolatore di pressione di precisione con due o più canali di uscita per controllare il flusso del fluido. Quindi, riempire a metà le fiale con il campione e il tampone, rispettivamente, con due fori nei loro tappi, e collegarli all'ingresso del chip.
   NOTA: Un regolatore di pressione di precisione con due o più canali di uscita può essere sostituito con più regolatori di pressione di precisione. All'ingresso del buffer, un buffer in grado di generare un flusso laminare che impedisce al campione di spostarsi al centro durante l'iniezione del campione viene iniettato attraverso un controller di flusso.
5. Dopo aver preparato il dispositivo, iniettare il campione e il tampone applicando una pressione di 2 kPa all'ingresso del campione e di 4 kPa all'ingresso del tampone utilizzando il dispositivo di controllo della pressione di precisione.
   NOTA: In questo momento, per un flusso laminare regolare, la pressione di iniezione del tampone deve essere superiore alla pressione di iniezione del campione. Il flusso è controllato da un regolatore di flusso fissato all'aspiratore collegato al canale di aspirazione.
6. Mettere a fuoco una perlina utilizzando il trasduttore piezoelettrico (PZT) per spostarla al centro del canale microfluidico mentre si controlla attraverso il microscopio.
   NOTA: Più grande è la perlina, maggiore è l'effetto sulla forma d'onda, quindi è più facile allinearsi con il punto del nodo. Un generatore di funzioni con un amplificatore applica potenza al PZT per generare un'onda sinusoidale nel microcanale. Poiché le parti superiore e inferiore del microcanale sono realizzate in vetro, l'onda sinusoidale generata viene riflessa e crea un punto nodale.
7. Utilizzando un generatore di funzioni a canale singolo, generare una frequenza di risonanza di 3,66 MHz e amplificare un segnale tipico di 16 dB (circa nove volte) utilizzando un amplificatore di potenza (Figura 1).
   NOTA: La frequenza di risonanza dell'attuatore deve corrispondere alle dimensioni del canale, poiché il canale è quadrato, il PZT funziona a una frequenza accurata per creare un singolo nodo.
8. Osserva i processi di separazione e arricchimento sul chip acustofluidico con un microscopio a fluorescenza e una fotocamera ad alta velocità che opera a 1.200 fps (fotogrammi al secondo).
9. Quantificare e analizzare la presenza o l'assenza di batteri Gram-negativi (GN) e batteri Gram-positivi (GP) controllando le immagini scattate con la fotocamera per microscopio a fluorescenza delle microsfere legate ai batteri e dei batteri scaricati attraverso i campioni di raccolta e di scarico.
   NOTA: Le microsfere con tampone, batteri e aptameri passano attraverso il canale principale e le microsfere sono allineate centralmente tramite acustoforesi in-chip indotta dal PZT. Infine, le microsfere che hanno legato i batteri GN vengono raccolte presso l'uscita di raccolta e i batteri non raccolti vengono scaricati attraverso l'uscita di scarico.

Risultati

Figura 1: Schema del sistema acustofluidico utilizzato per separare e raccogliere le cellule. Il campione o la soluzione tampone viene iniettato nella porta di ingresso attraverso il controller di flusso. Per il centraggio del cordone...

Materiali