Saggio in vivo per correlare la bioluminescenza batterica con la densità cellulare

Abstract

Fonte: Brodl, E., et al. Misura in situ e correlazione della densità cellulare e dell'emissione luminosa di batteri bioluminescenti. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra la misurazione e la correlazione della bioluminescenza con la densità cellulare nei batteri trasformati. Una singola colonia batterica viene utilizzata per avviare una coltura liquida. La coltura viene posta in un pozzetto alla concentrazione cellulare desiderata. Un antibiotico e un induttore vengono aggiunti per esprimere il gene necessario per la bioluminescenza batterica. Le letture per l'assorbanza e la bioluminescenza vengono effettuate a intervalli regolari utilizzando un lettore di piastre.

Protocollo

1. Progettazione, preparazione ed espressione dell'operone lux in Escherichia coli

Nota: Vedere la Tabella dei materiali per informazioni sui kit commerciali utilizzati in questa sezione.

1. Per trasferire l'operone lux in E. coli scegliere un vettore pET standard con siti di restrizione appropriati e gene di resistenza agli antibiotici di interesse (ad esempio, pET28a; NcoI, XhoI, kanamicina).
2. Progetta i frammenti e i primer sovrapposti per l'assemblaggio di Gibson sulla base della sequenza di DNA di Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. Impostare una reazione standard di reazione a catena della polimerasi (PCR) con i primer progettati e il DNA genomico isolato (acido desossiribonucleico) di Photobacterium mandapamensis 27561 come modello.
   NOTA: L'isolamento del DNA genomico del rispettivo ceppo batterico migliora l'efficacia della PCR.
4. Purificare il prodotto PCR mediante purificazione a colonna rotante.
5. Eseguire la digestione di restrizione del vettore pET28a isolato con NcoI e XhoI a 37 °C per 45 minuti.
6. Purificare il vettore linearizzato e i frammenti di PCR tramite elettroforesi su gel di agarosio e successiva purificazione in colonna di spin.
7. Determinare la concentrazione di DNA di ciascun frammento e del vettore linearizzato e calcolare le quantità ottimali per l'assemblaggio secondo il protocollo.
   NOTA: L'efficacia dell'assemblaggio dipende dalle dimensioni e dal numero di frammenti e deve essere regolata in base al protocollo del produttore.
8. Dopo aver combinato tutti i frammenti e il tampone in una provetta per PCR, incubare la miscela di assemblaggio in una macchina per PCR a 50 °C per 1 ora.
9. Trasformare il prodotto vettoriale assemblato secondo i protocolli di trasformazione standard per la trasformazione del plasmide batterico di E. coli in un sistema appropriato di E. coli per la replicazione di plasmidi ad alto rendimento (ad esempio, E. coli TOP10 o XL-1).
10. Raccogli le colonie dalla piastra di trasformazione e strisciale su nuove piastre per l'isolamento del DNA.
11. Isolare il DNA plasmidico secondo i protocolli standard.
12. Per verificare il corretto assemblaggio del plasmide, compresi tutti i frammenti, eseguire prima una PCR di colonia secondo protocolli standard utilizzando primer specifici per ogni frammento assemblato.
13. Oltre alla PCR della colonia e alla successiva elettroforesi su gel di agarosio, preparare tutti i vettori di assemblaggio isolati per il sequenziamento del DNA per verificare il corretto assemblaggio e le corrette sequenze di DNA.
14. Trasformare il plasmide verificato secondo i protocolli di trasformazione standard per la trasformazione del plasmide batterico di E. coli in un sistema appropriato per la produzione di proteine ad alto rendimento (ad es. E. coli BL21).
    NOTA: Continuare direttamente con il protocollo di espressione riportato di seguito. Per una conservazione più lunga, si consiglia la preparazione di un brodo di glicerolo.

2. Espressione di ceppi modificati di E. coli

1. Preparare una coltura notturna (ONC) per l'espressione mediante inoculazione di un volume appropriato di terreno di Luria-Bertani (LB) (ad esempio, 100 mL) con lo stock di glicerolo precedentemente preparato delle cellule BL21 di E. coli trasformate con il plasmide assemblato o direttamente da una piastra di trasformazione. Aggiungere 100 μL di kanamicina (50 mg/mL; gene della resistenza agli antibiotici di pET28a) e incubare l'ONC a 37 °C e 120 giri/min in un agitatore incubatore per una notte.
2. Inoculare la coltura di espressione principale (ad es. 800 mL di terreno LB) con 8 mL di ONC e aggiungere 800 μL di kanamicina (50 mg/mL).
3. Incubare la coltura principale a 37 °C e 120 giri/min in un agitatore incubatore fino a quando la densità cellulare raggiunge un OD₆₀₀ di 0,6 - 0,8 (circa 2,5 ore).
4. Ridurre la temperatura di incubazione a 28 °C.
5. Indurre l'espressione proteica aggiungendo propil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a una concentrazione finale di 0,1 mM.
   NOTA: Test empirici hanno dimostrato che la riduzione della temperatura a 28 °C ha dato la massima intensità luminosa.
6. Osservare le cellule fino a quando non iniziano a brillare (circa 1 ora).
   NOTA: A seconda dello scopo dell'espressione, le cellule vengono coltivate fino al giorno successivo e poi raccolte, oppure le cellule possono essere mantenute agitate finché brillano (massimo 48 ore). La raccolta delle cellule e la purificazione di qualsiasi proteina possono essere eseguite secondo le procedure standard.

3. Espressione di ceppi batterici bioluminescenti

NOTA: I ceppi batterici bioluminescenti richiedono uno specifico mezzo di crescita/terreno di acqua di mare artificiale per la crescita e la produzione di luce.

1. Preparare un substrato di acqua di mare artificiale composto da due componenti del substrato preparati separatamente.
   NOTA: Le seguenti quantità si riferiscono a 1 L di terreno liquido o 1 L di terreno agar.
   Per
   1. il mezzo di acqua di mare artificiale, pesare i seguenti sali: 28.13 g NaCl (Cloruro di sodio), 0.77 g KCl (Cloruro di potassio), 1.60 g CaCl₂ · 2H₂O (Cloruro di calcio diidrato), 4.80 g MgCl₂ · 6H₂O (Cloruro di magnesio esaidrato), 0.11 g NaHCO₃ (Bicarbonato di sodio), e 3.50 g MgSO₄ · 7H₂O (Solfato di magnesio eptaidrato).
   2. Aggiungere 1 L di acqua distillata e sciogliere tutti i componenti.
   3. Per LB medium, pesare i seguenti ingredienti: 10 g di estratto di lievito, 10 g di peptone e, per le piastre di agar, altri 20 g di agar.
   4. Aggiungere 250 ml di acqua di rubinetto e sciogliere i componenti.
   5. Autoclavare separatamente entrambi i terreni preparati a 121 °C per 20 minuti.
   6. Per le piastre di agar, combinare 250 mL di terreno LB con 750 mL di terreno di acqua di mare artificiale subito dopo la sterilizzazione in autoclave e preparare le piastre.
   7. Per il terreno liquido, combinare 250 ml di terreno LB con 750 ml di terreno di acqua di mare artificiale subito dopo l'autoclavaggio o quando si è raffreddato.
      NOTA: Il mezzo di acqua di mare artificiale può torbidire a causa della precipitazione salina.
2. Striare i ceppi batterici bioluminescenti su piastre artificiali di agar con acqua di mare e incubare per una notte a 24 - 30 °C.
   NOTA: La conservazione a lungo termine dei ceppi batterici si ottiene normalmente attraverso il congelamento delle scorte di glicerolo della coltura batterica. I ceppi devono sempre essere striati prima su piastre di agar per garantire condizioni di partenza uniformi per tutti i ceppi, prima dell'uso per colture liquide, a causa di una fase di ritardo nella crescita dopo lo scongelamento.
3. Preparare un ONC inoculando 100 ml di terreno di acqua di mare artificiale con una singola colonia dalla piastra. Incubare l'ONC a 24 - 30 °C e 120 giri/min in un agitatore incubatore per una notte.
4. Inoculare 800 ml di terreno di acqua di mare artificiale con 8 ml di ONC.
5. Incubare le cellule batteriche a 24 - 30 °C e 120 giri/min in un agitatore per incubatore.
   NOTA: Il profilo di intensità luminosa dei batteri bioluminescenti varia fortemente con la temperatura. A seconda dei meccanismi di regolazione della produzione di luce del rispettivo ceppo batterico, l'emissione di luce può iniziare dopo circa 1 - 6 ore.
6. Osservare le colture cellulari batteriche fino a quando non iniziano a brillare (circa 1 - 6 ore).
   NOTA: A seconda dello scopo dell'espressione, le cellule vengono coltivate fino al giorno successivo e poi raccolte, oppure le cellule possono essere mantenute agitate finché brillano. La raccolta delle cellule e la purificazione di qualsiasi proteina possono essere eseguite secondo le procedure standard.

4. Saggio di attività in vivo per ceppi batterici bioluminescenti e ceppidi E. coli modificati

NOTA: La conservazione prolungata dei ceppi si ottiene normalmente attraverso il congelamento delle scorte di glicerolo della coltura batterica. I ceppi devono sempre essere striati prima su piastre di agar per garantire condizioni di partenza uniformi per tutti i ceppi, prima dell'uso per colture liquide, a causa di una fase di ritardo nella crescita dopo lo scongelamento.

1. Strisciare il ceppo batterico bioluminescente desiderato o il ceppo modificato di E. coli su una piastra di agar e incubare a 28 °C durante la notte.
   NOTA: La temperatura di incubazione può variare da ceppo a ceppo e deve essere valutata empiricamente. Per poter confrontare i ceppi batterici bioluminescenti e i ceppi di E. coli modificati, le condizioni di crescita devono essere identiche.
2. Inoculare 3 mL di terreno con il rispettivo ceppo con una singola colonia da una piastra di agar e incubare le cellule a 28 °C e 180 giri/min in un agitatore incubatore per circa 1 - 2 ore.
3. Misurare la densità cellulare di una diluizione 1:10 della coltura liquida a 650 nm. Calcolare il rapporto e il volume per una coltura da 1 mL con un OD650 di 0,05.
   NOTA: Il successivo test del lettore di piastre determinerà la densità cellulare a 650 nm per evitare interferenze dovute all'emissione di luce dei ceppi.
4. Pipettare il volume calcolato di coltura e terreno in una piastra a 24 pozzetti con pareti nere e fondo di vetro. Per il ceppo modificato di E. coli, aggiungere ai campioni 1 μL di kanamicina (resistenza agli antibiotici del vettore pET28a) e 1 μL di IPTG (induzione dell'espressione genica). Mettere un coperchio sulla piastra per evitare l'evaporazione durante le misurazioni.
   NOTA: Per garantire che il vettore pET28a contenente l'intero operone lux non vada perso dalla coltura di E. coli, la kanamicina deve essere aggiunta a ciascun campione di E. coli nei pozzetti della piastra e per garantire che la produzione di luce delle cellule di E. coli possa essere misurata, l'espressione genica deve essere indotta dall'IPTG. Per evitare diafonie e interferenze di misura, le piastre a pozzetti con pareti nere con fondo in vetro e coperchi trasparenti hanno mostrato i migliori risultati. Tuttavia, la diafonia può essere osservata e le posizioni dei pozzi devono essere scelte con cura.
5. Avviare la misurazione in un lettore di piastre.
   NOTA: Il protocollo del lettore di piastre si basa su uno script sviluppato appositamente per questo test che combina due misurazioni, assorbanza e bioluminescenza. I punti dati vengono raccolti ogni 10 minuti con agitazione permanente tra le misurazioni e una temperatura costante di 28 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NEBuilder Kit di clonazione per l'assemblaggio del DNA ad alta fedeltà	New England Biolabs Inc.	E2621S	per 10 rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polimerasi	Thermo Scientific	F530S
Q5 DNA Polimerasi ad alta fedeltà	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet Kit di purificazione del DNA genomico	Thermo Scientific	K0721	per 50 rxn
Enzimi di restrizione e tampone (NcoI, XhoI)	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Kit di pulizia Wizard SV Gel e PCR	Promega	A9282	per 250 rxn
Kit di estrazione del gel di DNA Monarch	New England Biolabs Inc.	#T1020S	per 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0503	per 250 rxn
GoTaq G2 DNA Polimerasi	Promega	M7841
Piastra sensosa nera a 24 pozzetti con fondo in vetro	Greiner Bio One	662892
Lettore di piastre FLUOStar Omega	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysis Software	BMG Labtech		Versione 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker	Infors AG