Crescita dei batteri Magnetospirillum e valutazione del loro comportamento magnetotattico

Abstract

Fonte: Le Nagard, L., et al. Batteri magnetotattici in crescita del genere Magnetospirillum: ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra come coltivare i batteri Magnetospirillum in condizioni microaerobiche utilizzando terreni liquidi e semisolidi. Evidenzia la formazione di una banda batterica visibile all'interfaccia ossico-anossica e la sua migrazione verso l'alto quando l'ossigeno si esaurisce. Il video mostra anche come valutare il comportamento magnetotattico osservando il nuoto direzionale in risposta a un campo magnetico.

Protocollo

1. Inoculazione di batteri magnetotattici (MTB)

NOTA: Le colture dei ceppi AMB-1, MS-1 e MSR-1 possono essere ottenute commercialmente (Tabella dei materiali).

ATTENZIONE: Eseguire tutti i seguenti passaggi in condizioni sterili, sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen.

1. Inoculazione dei ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1 in mezzo liquido
   1. Sigillare un flacone di siero vuoto da 125 ml con un tappo in gomma butilica e un sigillo a crimpare in alluminio. Inserire due aghi nel flacone attraverso il tappo e collegare una siringa a uno di essi. Collegare la siringa a un cilindro di Ø₂ attraverso lo stesso tipo di tubo utilizzato per la stazione N₂.
   2. Lasciare che l'O₂ scorra attraverso la bottiglia per circa 30 minuti per assicurarsi che tutta l'aria nella bottiglia sia sostituita dall'O₂. Rimuovere entrambi gli aghi, consentendo una leggera sovrapressione nel flacone, quindi sterilizzare in autoclave. Lasciare raffreddare il flacone a temperatura ambiente prima dell'uso.
      NOTA: Per risparmiare tempo, eseguire i passaggi 1.1.1 e 1.1.2 durante la preparazione del mezzo e sterilizzare in autoclave il flacone insieme al mezzo o alle soluzioni madre.
   3. Sterilizzare la parte superiore dei tappi sia della bottiglia media fresca che della bottiglia O₂ applicando sopra alcune gocce di soluzione di etanolo al 70% e facendole passare attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen.
   4. Utilizzando una siringa sterile e un ago, estrarre 1 mL di O₂ dal flacone di O₂ e trasferirlo nel flacone del terreno fresco. Assicurarsi che l'ago aderisca perfettamente alla siringa durante questa fase per evitare che l'aria penetri nella siringa.
   5. Se si utilizza l'inoculo di un'altra coltura coltivata in una bottiglia di vetro, sterilizzare i tappi sia della bottiglia di terreno fresco che della bottiglia di coltura più vecchia applicando sopra alcune goccioline di soluzione di etanolo al 70% e facendole passare attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen. Se si utilizza l'inoculo da una provetta di coltura congelata, lasciarlo riscaldare a temperatura ambiente con la provetta sigillata sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen.
   6. Se si utilizza l'inoculo di un'altra coltura coltivata in una bottiglia di vetro, inoculare 1 ml di coltura più vecchia nel terreno fresco. Se si utilizza l'inoculo da un brodo congelato, inoculare solo 0,1 ml per diluire il glicerolo o il dimetilsolfossido (DMSO) utilizzati nel processo di congelamento. In entrambi i casi, utilizzare un ago sterile e una siringa sterile.
   7. Incubare la coltura a 32 °C e inocularela in terreno fresco dopo 4-7 giorni.
2. Inoculazione di MSR-1 in un mezzo semisolido gradiente O₂
   1. Verificare che la provetta di terreno fresco mostri un'interfaccia ossico-anossica (OAI) ben definita, materializzata da un'interfaccia rosa-incolore.
   2. Se l'inoculo proviene da un'altra coltura semisolida con gradiente di concentrazione di O₂, prelevare i batteri pipettando 50 μl di coltura con una punta di pipetta sterile posizionata sulla fascia formata dai batteri. Inoculare lentamente questi batteri all'OAI nel terreno fresco (interfaccia rosa/incolore), evitando di disturbare l'interfaccia. Se l'inoculo proviene da una coltura congelata, procedere allo stesso modo con 100 μL di inoculo
   .
   3. Sigillare la provetta e lasciare che i batteri crescano tra i 25 °C e i 30 °C. Trasferire in terreno fresco utilizzando la stessa procedura prima che la banda di batteri raggiunga la superficie del terreno.

2. Osservazione dei batteri

1. Sterilizzare il tappo della bottiglia di coltura applicando sopra una soluzione di etanolo al 70% e facendola passare attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen. Per un mezzo semisolido, aprire il tubo sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Utilizzare un ago sterile e una siringa sterile per estrarre i batteri.
2. Utilizzare il metodo della goccia sospesa8 per assicurarsi che i batteri siano sia magnetici che mobili.
   NOTA: La microscopia a contrasto di fase dà ottimi risultati, ma non è obbligatoria. Sono adatti ingrandimenti che vanno da 10X a 60X.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC ATCC	31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
L-cisteina.HCl.H₂O	Sigma-Aldrich	C7880-100G
Siringhe da 1,0 ml Fischer	scientific	B309659
aghi 25G x 1 BD		305125
flaconi di siero da 125 mL	Wheaton	223748
20 mm guarnizioni in alluminio	Wheaton	224223-01
20mm E-Z Crimper	Wheaton	W225303
tappi in gomma butilica	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Tubi Hungate	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Tappo del setto, 13 mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Provette per coltura in vetro	Corning (VWR)	9826-16X