Un metodo di microdiluizione in brodo per i test di suscettibilità agli antibiotici dei batteri Gram-positivi

Abstract

Fonte: Koeth, L. M., et. al., Un metodo di microdiluizione del brodo di riferimento per i test di suscettibilità in vitro della dalbavancina dei batteri che crescono aerobicamente. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra il metodo di microdiluizione in brodo per determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) di un antibiotico lipoglicopeptidico contro i batteri Gram-positivi. Copre l'isolamento delle colonie batteriche, la diluizione, l'inoculazione di pozzetti per micropiastre con concentrazioni di antibiotici variabili e la verifica della purezza della coltura e della conta cellulare. Il video spiega anche come il legame con gli antibiotici interrompa la sintesi della parete cellulare, portando alla lisi, e come identificare la MIC in base all'inibizione visibile della crescita.

Protocol

1. Preparare le diluizioni del pannello MIC

1. Preparare una soluzione madre non superiore a 1.600 μg/mL di dalbavancina in dimetilsolfossido (DMSO) puro (puro) in provette sterili di vetro o plastica e utilizzare lo stesso giorno della preparazione o conservare a una temperatura compresa tra -20 e -60 °C o inferiore per un uso futuro in un congelatore non scongelante. Quando si pesa la polvere, prendere in considerazione l'efficacia della dalbavancina come indicato nella documentazione ricevuta con la polvere.
2. Diluire la diluizione madre in modo simile allo schema con DMSO pulito in tubi sterili di vetro o plastica. Utilizzare una pipetta per misurare il diluente e un'altra pipetta per aggiungere la riserva iniziale di dalbavancina alla prima provetta. Per ogni successiva concentrazione di dalbavancina utilizzare una nuova pipetta.
3. Preparare le diluizioni finali 100X della concentrazione del pannello MIC (concentrazioni intermedie) con DMSO pulito. Combinare volumi appropriati di sorgente e DMSO per ottenere la concentrazione intermedia desiderata (i volumi da utilizzare dipenderanno dal numero di pannelli MIC da realizzare).
4. Preparare 0,004% P80: Preparare una soluzione madre fresca di P80 al 2% aggiungendo 0,1 mL di P80 a 4,9 mL di dH₂O. Sterilizzare passando attraverso un filtro da 0,22 μm e utilizzare la soluzione lo stesso giorno della preparazione. Preparare il diluente P80 allo 0,004% effettuando una diluizione 1:500 di P80 al 2% (ad esempio, 0,3 mL di P80 al 2% a 149,7 mL di CAMHB).
5. Inoltre, diluire le concentrazioni intermedie 1:100 in brodo di Mueller Hinton aggiustato per i cationi (CAMHB) integrato con polisorbato-80 (P-80) allo 0,004% (v/v) e/o LHB (per streptococchi) aggiunti al doppio della concentrazione finale perché l'aggiunta di inoculo risulterà in una diluizione 1:2.

2. Preparare i pannelli MIC

1. Erogare 50 μl di ciascuna soluzione di dalbavancina preparata in pozzetti appropriati del pannello MIC e includere il terreno in un solo pozzetto (pozzetto di controllo della crescita). Per questa fase è possibile utilizzare una pipetta multicanale con puntali sterili.
2. Utilizzare immediatamente i pannelli o sigillarli con pellicola di plastica, metterli in sacchetti di plastica e metterli immediatamente in un congelatore non sbrinabile a ≤ -20 °C (preferibilmente a ≤ -60 °C) fino al momento del bisogno. Se si utilizzano pannelli congelati, rimuovere i sigilli e posizionare i singoli pannelli sul banco da laboratorio per 15-30 minuti (fino a quando il contenuto del pozzetto non viene scongelato) prima di procedere all'inoculazione del pannello.

3. Inoculare i pannelli MIC, eseguire la purezza e impostare il conteggio delle colonie

1. Selezionare diverse colonie ben isolate da un agar sanguigno 18-24 ore o da un'altra piastra di agar non selettiva. Toccare la parte superiore di ciascuna colonia con un'ansa sterile o un tampone e trasferire a 1-5 ml di CAMHB o soluzione fisiologica fino a quando la torbidità non è equivalente a uno standard di McFarland di 0,5. Valutare la torbidità mediante confronto visivo con il McFarland 0,5 o con un dispositivo fotometrico.
2. Entro 15-30 minuti dalla preparazione, diluire l'inoculo 1:100 in CAMHB (100 μl in 10 ml di CAMHB). Per la maggior parte dei batteri testati contro la dalbavancina, ad eccezione di S. pneumoniae, questa diluizione fornirà una concentrazione finale del pozzetto di 5 × 10⁵ UFC/mL (l'intervallo accettabile è 2-8 × 10⁵ UFC/mL). Per S. pneumoniae, la concentrazione batterica basata su un confronto della torbidità con un McFarland di 0,5 è in genere considerevolmente inferiore. Pertanto, diluire l'inoculo 1:25 (400 μL in 10 mL di CAMHB + 10% LHB).
3. Entro 15 minuti dalla preparazione dell'inoculo, trasferire 50 μl dell'inoculo finale in ciascun pozzetto (ad eccezione del pozzetto di controllo della sterilità) del pannello MIC preparato. Per questa fase è possibile utilizzare una pipetta multicanale con puntali sterili.
4. Eseguire un controllo della purezza trasferendo e distribuendo un'aliquota di 1-10 μl dal pozzetto di controllo positivo della crescita utilizzando un ansa sterile a un agar non selettivo (ad esempio, agar di soia tripticasi con il 5% di sangue di pecora).
5. Impostare la conta delle colonie rimuovendo 10 μl dal pozzetto di controllo della crescita con una pipetta monocanale e un puntale sterile e trasferendo a 10 mL di soluzione fisiologica (diluizione 1:1.000). Miscelare e trasferire 100 μl con una pipetta monocanale e un puntale sterile in un terreno di agar non selettivo adatto (ad es. tripticasi agar di soia con il 5% di sangue di pecora) e distribuire su tutta la superficie dell'agar con un circuito sterile, ripetendo due volte in direzioni diverse per garantire una distribuzione uniforme dell'inoculo (diluizione 1:10).

4. Incubare i pannelli MIC, il conteggio delle colonie e le piastre di purezza

1. Prima dell'incubazione, sigillare ogni pannello MIC o pila di non più di quattro pannelli in un sacchetto di plastica con nastro adesivo o con un coperchio di plastica aderente. In alternativa, posizionare un pannello MIC vuoto sopra la pila di non più di 4 pannelli MIC, posizionare un tovagliolo di carta umido in un contenitore di plastica, posizionare i pannelli MIC nel contenitore di plastica e chiudere saldamente il contenitore con un coperchio. Incubare i pannelli MIC in un incubatore ad aria ambiente a 35 °C ± 2 °C per 16-20 ore (stafilococchi ed enterococchi) e 20-24 ore (streptococchi) entro 30 minuti dall'inoculazione. Incubare la conta delle colonie e le piastre di purezza nelle stesse condizioni, ad eccezione dell'incubazione degli streptococchi in un incubatore al 5% di CO₂.

5. Leggere le piastre MIC e conteggio delle colonie; Leggere

1. la MIC come la concentrazione più bassa che inibisce completamente la crescita batterica nei pozzetti, rilevata ad occhio nudo.
2. Conta le colonie sulla targhetta di conteggio delle colonie. Moltiplicare ogni colonia per il fattore di diluizione (1:10.000) (ad esempio, 50 colonie equivalgono a 5 × 10⁵ UFC/mL). Un intervallo accettabile è di 20-80 colonie (2-8 × 10⁵ UFC/mL) e viene utilizzato come linea guida approssimativa.
3. Controllare la targhetta di purezza. Se tutte le colonie sono simili a ciascuna colonia, allora l'inoculo può essere considerato puro. Se sono presenti altre colonie, è possibile che sia presente un contaminante nel pannello MIC e il test deve essere ripetuto.

Materials