Visualizzazione mediata da nanoparticelle del rimodellamento endolisosomiale in cellule infettate da batteri

Abstract

Fonte: Zhang, Y., et al. Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare il rimodellamento del sistema endo-lisosomiale da parte di batteri intracellulari. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra l'uso di nanoparticelle fluorescenti per visualizzare il rimodellamento endolisosomiale nelle cellule epiteliali umane infettate da batteri intracellulari. In seguito all'invasione batterica, i patogeni manipolano il citoscheletro dell'ospite e il sistema endo-lisosomiale, formando vacuoli con proiezioni tubulari che alterano il trasporto delle vescicole. Le nanoparticelle marcate in fluorescenza vengono quindi utilizzate per tracciare questi cambiamenti, consentendo l'imaging ad alta risoluzione degli eventi di traffico intracellulare indotti da agenti patogeni.

Protocollo

1. Coltura di cellule HeLa
   1. Le cellule HeLa che esprimono permanentemente LAMP1-GFP (glicoproteina di membrana associata al lisosoma 1-Proteina fluorescente verde) vengono coltivate nel Medium Modified Eagle di Dulbecco, o DMEM con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) e coltivate a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO₂.
   2. Seminare le cellule a una densità di 50.000 per pozzetto in un vetrino a camera a 8 pozzetti (Ibidi) e incubare durante la notte (O/N).
2. Coltura di batteri
   1. Usa il ceppo wild-type (WT) di Salmonella enterica sierovariante Typhimurium NCTC 12023. Per confronto, utilizzare ceppi mutanti ΔssaV difettosi in SPI2-T3SS e ΔsifA privi dell'effettore chiave SifA per SIF. Utilizzare ceppi che ospitano il plasmide pFPV25.1 per l'espressione costitutiva di GFP.
      NOTA: I ceppi batterici vengono coltivati di routine nel brodo di Luria-Bertani (LB) con l'aggiunta di 50 μg/ml di carbenicillina (WT) e LB con l'aggiunta di 50 μg/ml di carbenicillina e/o 50 μg/ml di kanamicina (ΔssaV, ΔsifA) necessari per mantenere i plasmidi.
   2. Inoculare una singola colonia di batteri in 3 ml di LB con antibiotici appropriati e far crescere O/N a 37 ºC in condizioni di agitazione per l'aerazione, quindi diluire 1:31 in LB fresco e continuare la crescita per 3,5 ore. A questo punto, le colture raggiungono la fase di logaritmia tardiva e i batteri sono altamente invasivi. Un "tamburo a rulli" è comodo per incubare colture in provetta con aerazione.
3. Infezione delle cellule HeLa da Salmonella e Nanoparticelle di Oro-BSA-Rodamina o NP Pulse Chase Labeling (vedi Figura 1 per lo schema)
   1. Misura OD₆₀₀ dei batteri sub-coltivati e diluisci a OD₆₀₀ = 0.2 in 1 ml Soluzione salina tamponata con fosfato o PBS (~3 × 10⁸ ufc/ml), aggiungere quantità appropriate di batteri alle cellule HeLa in vetrini a 8 pozzetti per ottenere una molteplicità di infezioni (MOI) di 100.
   2. Incubare per 30 minuti nell'incubatore cellulare, lavare 3 volte con PBS per rimuovere i batteri non internalizzati (questo punto temporale è stato impostato a 0 ore dopo l'infezione, o 0 ore p.i.). Aggiungere 300 μl di terreno di coltura fresco contenente 100 μg/ml di gentamicina e mantenere per 1 ora. Quindi sostituire il terreno con un terreno fresco contenente 10 μg/ml di gentamicina per il resto del tempo di incubazione.
   3. Dopo l'incubazione con terreno di coltura contenente 100 μg/ml di gentamicina per 1 ora, il terreno viene sostituito da un terreno di imaging (MEM di Eagle senza FCS, L-glutammina, rosso fenolo e bicarbonato di sodio, con 30 mM HEPES, pH 7,4) contenente 10 μg/ml di gentamicina. Le NP di oro-BSA-rodamina vengono aggiunte alle cellule HeLa per ottenere una concentrazione finale di OD₅₂₀ = 0,1. (Albumina sierica bovina, o BSA)
      NOTA: Le NP di oro-BSA-rodamina possono anche essere aggiunte alle cellule prima dell'infezione, o in vari punti temporali p.i.
   4. Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere il terreno, lavare 3 volte con PBS e aggiungere 300 μl di terreno di imaging fresco contenente il 10% di FCS e 10 μg/ml di gentamicina per il resto del tempo di incubazione.
      NOTA: La durata dell'incubazione può variare a seconda della concentrazione di NP e delle linee cellulari utilizzate. Per i macrofagi RAW264.7, abbiamo osservato che un'incubazione di 30 minuti con NP a una concentrazione di OD₅₂₀ = 0,05 ha permesso un'internalizzazione sufficiente.

Risultati

Figura 1. Schema per la preparazione di cellule HeLa per l'imaging di cellule vive. Le cellule HeLa sono state seminate in vetrini da camera, finte infettate o infettate con vari ceppi di Salmonella per 30 minuti, lavate 3 volte con...

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