Coltura di Mycobacterium tuberculosis in condizioni di restrizione del ferro

Abstract

Fonte: Gupta, S., et al. Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari prodotte da micobatteri ferro-limitati. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra la procedura per coltivare il Mycobacterium tuberculosis in condizioni di ferro limitato per indurre stress da ferro e promuovere la secrezione di siderofori che supportano la sopravvivenza batterica.

Protocollo

1. Coltivazione di micobatteri in condizioni di limitazione del ferro

1. Scongelare 50 μL di una scorta congelata di glicerolo al 15% di Mtb (Mycobacterium tuberculosis) e striare una piastra di agar integrata con un arricchimento ADN (Albumina – Destrosio – NaCl) al 10% (5 g/L di albumina, 2 g/L di destrosio e 0,85 g/L di cloruro di sodio, 0,2% di glicerolo e 0,05% di Tween-80). Incubare la piastra a 37 °C fino a quando le colonie sono visibili.
2. Inoculare una singola colonia di Mtb in 2 mL di terreno di brodo micobatterico (Tabella dei materiali) integrato con arricchimento di ADN. Incubare agitando a 37 °C.
3. Lascia che la cultura Mtb cresca fino alla fase logaritmica tardiva (OD₅₄₀ è ~0,8). Per verificarlo, misurare l'OD₅₄₀ utilizzando uno spettrofotometro.
4. Distribuire 200 μl della coltura logaritmica tardiva sulle piastre di agar micobatterico (Tabella dei materiali) integrate con glicerolo allo 0,2%, Tween-80 allo 0,05% e ADN. Inoculare almeno 5 piastre. Incubare le piastre a 37 °C fino a quando la crescita batterica è visibile come strato confluente. Questo richiede ~ 1 settimana per Mtb.
5. Inumidire un batuffolo di cotone sterile in LIMM (terreno minimo a basso contenuto di ferro). Utilizzare questo tampone per raccogliere i batteri dalle piastre di agar e inoculare 100 ml di LIMM per preparare una sospensione batterica concentrata con un OD₅₄₀ di ~1,0.
6. Diluire questa sospensione 10 volte fino a 1 L con LIMM e dividerla in due flaconi di plastica sterili da 2 L, ciascuno contenente 500 mL di coltura.
7. Estrarre 2 mL di coltura e trasferirla in una provetta da 5 mL. Aggiungere 10 μl di tiloxapol al 10% vol/vol.
8. Incubare le colture a 37 °C per 14 giorni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Piastre di agar micobatteriche
Brodo Middlebrook 7H9	BD Difco	271310	Brodo micobatterico medio
Provetta da centrifuga in polipropilene a parete sottile 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	Provetta da centrifuga in polipropilene a parete sottile 13x15 mm
Palloni filtranti sottovuoto	CellPro	V50022	Unità filtro