Isolamento di vescicole extracellulari contenenti siderofori da Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Fonte: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari prodotte da micobatteri limitati al ferro. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'isolamento graduale di vescicole extracellulari (EV) da Mycobacterium tuberculosis coltivate in condizioni limitanti il ferro che imitano l'ambiente ospite. Descrive l'uso dell'ultrafiltrazione, della centrifugazione differenziale e della separazione in gradiente di densità per arricchire e identificare le frazioni contenenti EV.

Protocollo

1. Raccolta di vescicole extracellulari micobatteriche (MEV)

1. Misurare l'OD₅₄₀ della coltura da 2 ml al momento del prelievo. Effettuare diluizioni seriali 1:10 della coltura e piastra 100 μl di ciascuna diluizione su piastre di agar con ADN e Tween-80 allo 0,05%.
2. Trasferire la coltura in cinque provette da centrifuga coniche da 225 mL e centrifugare a 2.850 x g per 7 minuti a 20 °C.
3. Raccogliere il surnatante di coltura con una pipetta da 50 ml e sterilizzarlo con filtro attraverso un'unità filtrante da 0,22 μm.

2. Isolamento dei MEV

1. Trasferire il filtrato di coltura in un sistema di ultrafiltrazione a celle agitate posizionato a 4 °C e filtrare il concentrato a <50 psi attraverso una membrana di taglio da 100 kDa a ~50 mL.
2. Centrifugare il filtrato di coltura concentrato a 15.000 x g per 15 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante.
3. Centrifugare il filtrato di coltura in provette di ultracentrifugazione in policarbonato a 100.000 x g per 2 ore a 4 °C.
4. Risospendere i pellet membranosi in un totale di 1 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) mediante pipettaggio delicato.
5. Miscelare 0,5 mL della sospensione in pellet ottenuta nella fase 2.4 con 1,5 mL di soluzione di iodixanolo al 60%, ottenendo una concentrazione finale di iodixanolo del 45% in peso/vol. Erogare questa miscela sul fondo di una provetta per ultracentrifuga in polipropilene a parete sottile da 13 mm x 51 mm.
6. Sovrapporre la sospensione MEV-iodixanol 45% con 1 mL di soluzioni di iodixanolo al 40%, 35%, 30%, 25% e 20% (vol/vol in PBS) e 1 mL di PBS nella parte superiore.
7. Centrifugare a 100.000 x g per 18 ore a 4 °C.
8. Raccogliere le frazioni del gradiente di densità da 1 mL partendo dall'alto utilizzando una siringa Hamilton da 1 mL.
9. Diluire ogni frazione raccolta a 20 mL con PBS e centrifugare a 100.000 x g per 2 ore a 4 °C.
10. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in 0,5 mL di PBS. Conservare questo pellet a 4 °C.

Materiali