Questo video mostra l'isolamento e la concentrazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dalla membrana esterna di batteri geneticamente modificati. Il processo prevede la coltura dei batteri per rilasciare le vescicole extracellulari, seguita da fasi sequenziali di centrifugazione e filtrazione per rimuovere cellule e detriti. Infine, l'ultrafiltrazione viene utilizzata per concentrare le vescicole extracellulari per l'analisi a valle.
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Articolo metodologico
Isolamento e arricchimento di vescicole extracellulari derivate dalla membrana esterna da batteri
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26 settembre 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Ceppi batterici e condizioni colturali
NOTA: I ceppi batterici utilizzati in questo studio sono stati Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve e Bifidobacterium dentium.
1. Per E. coli, utilizzare un circuito sterile per inoculare singole colonie in 250-1.000 ml di brodo Luria-Bertani (LB) e incubare aerobicamente in un incubatore vibrante a 300 giri/min e 37 °C per 48 ore prima di elaborare la coltura. Per il ceppo ricombinante di E. coli MP1 contenente p114-mCherryClyluc, aggiungere cloramfenicolo all'agar L....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tappo piatto da 0,5 mL, provette per PCR a parete sottile | Termo Scientifico | 3430 | è importante utilizzare provette PCR a parete sottile per ottenere letture accurate con Qubit |
| Soluzione acquosa di paraformaldeide (formaldeide) al 16% | Scienze della microscopia elettronica | 15700 | |
| Flaconi da centrifuga in polipropilene Fiberlite da 250 mL | ThermoFisher | 010-1495 | |
| Flaconi da centrifuga in polipropilene Fiberlite da 500 mL | ThermoFisher | 010-1493 | |
| Adattatore per bottiglia a fondo tondo/conico in polipropilene da 65 mm | Beckman Coulter | 392077 | Consente a Vivacell di adattarsi al rotore |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Centrifuga Avanti J-20 XPI | Beckman Coulter | Non più venduto da Beckman. Avanti J-26XP è il modello contemporaneo più vicino. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brodo per infuso di cuore cerebrale (BHI) | Himedia | Visualizzazione del materiale M2101 | Dopo la sterilizzazione in autoclave, sia il brodo BHI che l'agar sono stati introdotti nella camera anaerobica, integrati con menadione (1 μg/L), ematina (1,2 μg/L) e L-cisteina cloridrato (0,05%). Sono stati quindi incubati per almeno 24 ore in condizioni anaerobiche prima dell'inoculazione con i ceppi batterici anaerobi. |
| Cartuccia microfluidica C-300 | Spettrodina | ||
| Cloramfenicolo | MP Biomedicali | ICN19032105 | |
| Escherichia coli HST08 (Cellule competenti di Steller) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dott. Mark Goulian (regalo) | batteri commensali derivati dall'intestino del topo | |
| Adattatore Fiberlite da 500 mL a 250 mL | ThermoFisher | 010-0151-05 | utilizzato con il rotore Fiberlite per consentire l'utilizzo di flaconi da 250 mL per colture batteriche di avviamento di dimensioni ridotte |
| Rotore per centrifuga ad angolo fisso Fiberlite | ThermoFisher | F12-6x500-LEX | adatto per 6 flaconi da 500 mL |
| Lauria Bertani (LB) brodo, Miller | Difco | 244620 |
