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1. Ceppi batterici e condizioni colturali
NOTA: I ceppi batterici utilizzati in questo studio sono stati Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve e Bifidobacterium dentium.
1. Per E. coli, utilizzare un circuito sterile per inoculare singole colonie in 250-1.000 ml di brodo Luria-Bertani (LB) e incubare aerobicamente in un incubatore vibrante a 300 giri/min e 37 °C per 48 ore prima di elaborare la coltura. Per il ceppo ricombinante di E. coli MP1 contenente p114-mCherryClyluc, aggiungere cloramfenicolo all'agar LB e brodare a una concentrazione finale di 17 μg/mL.
2. Per A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve e B. dentium, striare su piastre di agar Brain Heart Infusion (BHI) e incubare anaerobicamente all'interno di una camera anaerobica in vinile. Inoculare singole colonie in 100 ml di brodo BHI pre-ridotto e incubare per 48 ore in modo anaerobico.
2. Isolamento EV
1. Chiarificazione del terreno di coltura batterica mediante centrifugazione e filtrazione
1. Trasferire le colture cellulari batteriche inoculate nella fase 1 per pulire i flaconi da centrifuga in polipropilene da 250 mL o 500 mL mediante versamento. Centrifugare le bottiglie in un rotore ad angolo fisso di grande capacità a 4 °C e 5.000 × g per 15 minuti. Trasferire il surnatante nei flaconi da centrifuga puliti versando con cura e centrifugare nuovamente a 10.000 × g per 15 minuti.
NOTA: Riutilizzare i flaconi dopo una pulizia e una decontaminazione adeguate alla biosicurezza.
1. Se dopo la seconda centrifugazione sono presenti pellet di cellule batteriche di grandi dimensioni, ripetere la centrifugazione in un flacone pulito per rimuovere ulteriormente le cellule.
2. Trasferire il surnatante in un dispositivo filtrante a vuoto in polietersulfone da 0,22 μm di dimensioni adeguate mediante colata. Filtrare collegando il dispositivo di filtrazione a un'alimentazione a parete a vuoto. Se la velocità di filtrazione diminuisce in modo significativo, è sufficiente spostare il materiale non filtrato in un nuovo dispositivo. Conservare il terreno filtrato a 4 °C per una notte e, se lo si desidera, continuare il protocollo il giorno successivo.
NOTA: Le centrifugazioni di cui sopra consentono in genere l'elaborazione di ~2 volte il volume indicato di coltura cellulare attraverso ciascun dispositivo. Ad esempio, un singolo dispositivo filtrante da 500 mL potrebbe filtrare ~1.000 mL di coltura precentrifugata. Questi dispositivi non vengono in genere riutilizzati. L'uso di filtri per siringa in questa fase non è raccomandato senza ottimizzazione, poiché con i modelli testati sono state notate perdite significative. Questo è un potenziale punto di arresto.
3. A questo punto, verificare la completa rimozione delle cellule vitali distribuendo un'aliquota del surnatante filtrato su apposite piastre di agar e garantire l'assenza di colonie dopo l'incubazione in condizioni ottimali per il ceppo batterico. Se vengono rilevati batteri, ottimizzare ulteriormente la procedura di cui sopra eseguendo ulteriori centrifugazioni e/o filtrazioni.
2. Concentrazione del mezzo filtrato
1. Se si lavora con volumi significativamente >100 mL, procedere al passaggio 2.2.2. Se si lavora con volumi di ~100 mL, caricare 90 mL di terreno di coltura filtrato sul serbatoio di un dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga con taglio del peso molecolare (MWCO) di capacità rispettiva di 100 kDa (MWCO) utilizzando pipette sierologiche. Bilanciare sempre con un dispositivo di ultrafiltrazione adatto e centrifugare in un rotore a secchiello oscillante a 4 °C e 2.000 × g per intervalli di 15-30 minuti, fino a quando il volume del fluido nel serbatoio superiore non è stato concentrato a <0,5 ml.
1. Rabboccare il serbatoio con il terreno di coltura filtrato rimanente. In caso di "rabbocco", rimuovere il flusso nella parte inferiore del dispositivo e ribilanciare tutti i dispositivi.
NOTA: È stato osservato che il volume massimo di terreno di coltura filtrato che può essere concentrato utilizzando questi dispositivi è <2 volte il volume raccomandato.
2. Se la viscosità del mezzo concentrato nel serbatoio è visibilmente aumentata (materiale scuro e viscoso), diluire con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e riconcentrare mediante centrifugazione per diluire le proteine non EV inferiori al MWCO di 100 kDa.
NOTA: Questo è un potenziale punto di arresto.
3. Trasferire il terreno concentrato in una provetta a basso contenuto proteico, conservare a 4 °C per una notte e, se lo si desidera, continuare il protocollo il giorno successivo.
2. Se si lavora con volumi significativamente >100 mL, selezionare un dispositivo di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) di dimensioni adeguate (100 kDa MWCO) per ospitare il volume da trattare.
NOTA: Sono disponibili in commercio dispositivi di filtrazione per il trattamento di 100 mL a >1.000 mL. La disponibilità locale, il costo e la compatibilità con la pompa e i tubi/connessioni determineranno quali modelli particolari saranno più utili. Fino a 2 L di terreno di coltura sono stati lavorati con il dispositivo indicato nella Tabella dei materiali prima di dover pulire il filtro (vedere il passaggio 2.3 di seguito per il protocollo di pulizia).
1. Assemblare un circuito di filtrazione con tubi #16 a basso binding/bassa lisciviazione, portagomma da 1/8 di pollice ad adattatori Luer, il dispositivo TFF e una pompa peristaltica.
NOTA: Eseguire il TFF all'interno di una cabina di biosicurezza per ridurre al minimo il rischio di contaminare la preparazione delle vescicole extracellulari con batteri ambientali.
2. A temperatura ambiente, iniziare a far circolare il terreno filtrato e condizionato a circa 200 mL/min (minimo 100 mL/min). Determinare il numero di giri appropriato corrispondente alla portata desiderata pompando 200 mL di PBS in un recipiente graduato. Quando si fa circolare un mezzo filtrato e condizionato, raccogliere le molecole <100 kDa che attraversano la membrana di ultrafiltrazione come rifiuti in un recipiente separato.
NOTA: L'esempio seguente presuppone un volume iniziale di 2 L di coltura.
3. Continuare a far circolare il terreno condizionato fino a quando il suo volume non si è ridotto a ~ 100-200 mL. Passare a recipienti più piccoli in base alle esigenze. Diluire 2 volte con PBS e continuare a far circolare con la pompa, concentrandosi fino a 75-100 mL. Diluire 2 volte con PBS e continuare a circolare fino a un volume finale di 25 mL. Diluire 2 volte con PBS e continuare a circolare fino a <10 mL.
4. Sollevare il tubo di alimentazione dal serbatoio del campione e continuare a pompare per spurgare il filtro e recuperare la quantità massima di campione.
NOTA: Questo è un potenziale punto di arresto.
5. Trasferire il campione concentrato in una provetta conica e conservarlo per una notte a 4 °C, se lo si desidera. In alternativa, continua con il protocollo.
6. Spostare il campione concentrato in un dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga MWCO da 15 mL con capacità di 100 kDa. Centrifugare in un rotore a secchio oscillante a 4 °C e 2.000 × g per intervalli di 15-30 minuti fino a quando il volume del terreno nel serbatoio superiore è stato concentrato a <2 mL.
NOTA: Questo è un potenziale punto di arresto.
7. Trasferire il terreno concentrato in una provetta a basso contenuto proteico e conservare a 4 °C per una notte, continuando il protocollo il giorno successivo, se lo si desidera.