$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)
NOTA: SEC viene utilizzato per aumentare la purezza delle vescicole extracellulari (EV) e rimuovere le proteine non vescicolari.
- Utilizzare una colonna SEC piccola (10 mL di volume del letto) per l'isolamento delle vescicole extracellulari da <100 mL di materiale di partenza e una colonna più grande (47 mL di volume del letto) per l'isolamento delle vescicole extracellulari da >100 mL di materiale di partenza.
NOTA: L'esempio seguente elencherà i volumi per la colonna più grande, con i volumi per la colonna più piccola tra parentesi. - Portare la colonna SEC e la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a temperatura ambiente per diverse ore. Stabilizzare la colonna SEC in posizione verticale utilizzando un supporto da laboratorio standard. In alternativa, utilizzare supporti per colonne per cromatografia commerciali.
- Prima di collegarlo alla colonna SEC, idratare il serbatoio del campione lasciando fluire 5 mL di PBS attraverso la fritta e in un contenitore di scarto. Svitare il tappo di ingresso della colonna SEC, aggiungere 2 mL di PBS al serbatoio del campione e collegare con cura il serbatoio alla colonna poiché il PBS gocciola attraverso la fritta (non applicabile per le colonne SEC piccole). NOTA: Questo passaggio precedente impedisce che eventuali bolle d'aria rimangano intrappolate nella parte superiore della colonna SEC. Se l'aria è intrappolata, rimuovere il serbatoio, picchiettare la colonna per far uscire la bolla d'aria e ripetere la procedura di connessione. Per la colonna più piccola, è sufficiente aprire la parte superiore della colonna SEC e collegare la tramoggia del campione.
- Aggiungere 47 mL (10 mL) di PBS al serbatoio del campione e stappare il fondo della colonna SEC. Lasciare che tutto il tampone del campione caricato fluisca attraverso la colonna per l'equilibratura. Scartare il flusso.
- Caricare un massimo di 2 mL (0,5 mL) di campione sul serbatoio del campione, scartare il flusso e lasciare che il campione entri completamente nella colonna.
- Aggiungere immediatamente il PBS al serbatoio o alla tramoggia del campione a un volume di 14,25 mL meno il volume del campione (3 mL meno il volume del campione, per la colonna piccola). Lasciare che la soluzione scorra attraverso la colonna e scartare questa quantità pari al volume vuoto della colonna.
NOTA: Per un campione tipico di 2 ml, la quantità di PBS da aggiungere al serbatoio o alla tramoggia del campione sarà di 12,25 ml. - Posizionare una microprovetta da 2 mL a basso legame direttamente sotto la colonna SEC. Aggiungere immediatamente 2 mL (0,5 mL) di PBS al serbatoio del campione e lasciarlo entrare nella colonna. Etichettare i primi 2 mL (0,5 mL) di flusso come Frazione 1. Continuare ad aggiungere 2 mL (0,5 mL) alla volta al serbatoio del campione per raccogliere ogni frazione successiva.
NOTA: La maggior parte delle vescicole extracellulari batteriche eluisce nelle prime 5 frazioni. Durante l'ottimizzazione, sono state raccolte le prime 12 frazioni. - Conservare le frazioni a 4 °C per la conservazione a breve termine (giorni) o a -80 °C per la conservazione a lungo termine.