Transinfezione batterica in vitro delle cellule T tramite formazione di sinapsi immunologiche

Abstract

Fonte: Cruz-Adalia, A., et al. Le cellule T catturano i batteri mediante transinfezione dalle cellule dendritiche. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra la transinfezione batterica attraverso interazioni tra cellule T antigene-cellule dendritiche. Le cellule dendritiche infettate da batteri che presentano il peptide dell'ovoalbumina vengono incubate con cellule T, direttamente o separate da una membrana. Il contatto diretto consente la formazione di sinapsi immunologiche, consentendo il trasferimento batterico, mentre la membrana impedisce l'interazione. Il trattamento con gentamicina viene quindi eseguito per eliminare i batteri extracellulari.

Protocollo

Nota: i topi sono stati allevati in stabulazioni prive di agenti patogeni specifici (SPF) e sono stati soppressi da personale addestrato e qualificato utilizzando il metodo dell'inalazione di anidride carbonica (CO₂).
1. Differenziazione e infezione delle cellule dendritiche (DC) derivate dal midollo osseo di topoNota: la Figura 1 riassume questo primo passo. Da questo momento in poi, tutte le procedure devono essere eseguite nella cappa, utilizzando solo terreni sterili, strumenti, puntali per pipette e piastre di coltura.

Differenziazione delle DC derivate dal midollo osseo di topo
1. Sezionare tibie e femori da un topo C57/BL6 e trasferirli in una capsula di plastica con 10 ml di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
2. Taglia ogni epifisi, con forbici sterili ed esponi il midollo osseo, che ha un caratteristico colore rosso vivo.
3. Infondere all'interno dell'osso 10 ml di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone PBS/BSA/EDTA) utilizzando una siringa sterile su una piastra di Petri sterile.
4. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare in una provetta a 600 x g in una centrifuga refrigerata (4 °C).
5. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone lisanti di ammonio-cloruro-potassio (ACK) (0,15 M di cloruro di ammonio (NH₄Cl), 10 mM di bicarbonato di potassio (KHCO₃) e 0,1 mM di EDTA) e incubare per 30 secondi a temperatura ambiente (RT) per eliminare i globuli rossi.
6. Aggiungere 10 ml di terreno RPMI 1640 con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e filtrare attraverso un colino cellulare (70 μm) per rimuovere frammenti ossei e grumi cellulari prima di centrifugare alla stessa velocità (600 xg) perché i grumi sono stati eliminati mediante filtraggio.
7. Contare le cellule e regolare a 5 x 10⁵ cellule/ml con RPMI 10% FBS (contenente 50 μM di B-mercaptoetanolo, 1 mM di piruvato di sodio) e aggiungere 20 ng/ml di fattore stimolante le colonie di granulociti murini ricombinanti (rm-GM-CSF) come concentrazione finale.
8. Aggiungere questa sospensione a una piastra di Petri sterile di qualità microbiologica di 15 cm e coltura in un incubatore di CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
9. Ogni tre giorni, centrifugare sia le cellule non aderenti che le cellule staccate con 5 mM di EDTA in PBS e risospendere a 5 x 10⁵ cellule/ml di densità cellulare, con terreno fresco contenente 20 ng/ml di rm-GM-CSF.
Maturazione delle DC e carico dell'antigene
1. Al giorno 9, risospendere le cellule a una densità di 5 x 10⁵ cellule/ml in un terreno contenente 20 ng/ml rm-GM-CSF. Quindi, aggiungere 20 ng/ml di lipopolisaccaride (LPS) per consentire un'elevata espressione del complesso maggiore di istocompatibilità o MHC-II sulle cellule e incubare in una piastra di Petri sterile da 15 cm non trattata con coltura tissutale per 24 ore.
2. Dopo un giorno di stimolazione con LPS, colorare alcune cellule DC con anticorpi contro CD11c, MHC-II e recettore dei granulociti-1 o Gr-1 di topo per controllare la differenziazione delle DC mediante citometria a flusso. Un esempio di analisi in citometria a flusso delle DC è mostrato nelle Figure 3A e 3B.
  1. Incubare le DC (5 x 10,⁵ cellule/campione) con un anticorpo monoclonale anti-topo-CD16/CD32 a 2,5 μg/ml di concentrazione finale in 50 μl di tampone PBS/BSA/EDTA per campione. Successivamente, aggiungere 50 μl di anticorpi contro MHC-II (I-A/I-E), CD11c e Gr-1 coniugati con diversi fluorocromi rispettivamente a 1:100, 1:200 e 1:500 in tampone PBS/BSA/EDTA.
  2. Infine, lavare i DC con tampone PBS/BSA/EDTA e analizzarli mediante citometria a flusso secondo il protocollo del produttore.
    Nota: se le cellule sono ben differenziate, sono pronte per il caricamento dell'antigene.
3. Lavare le DC con RPMI 10% FBS (senza antibiotici) e incubarle con 10 μg/ml di peptide OTII di ovoalbumina (OVAp) (OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E A G R) su una provetta di plastica in 1 ml di terreno RPMI 10% FBS per 5 x 10⁶ DC per un minimo di 1 ora a 37 ºC. Come controllo negativo, lasciare le DC senza incubare con OVAp.
Infezione delle DC
1. Infettare le DC con una molteplicità di infezioni (MOI) di 10 batteri (10 batteri per DC) per 1 ora in un incubatore di CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
2. Lavare le cellule DC 3 volte in PBS e 1 volta in RMPI 10% FBS e centrifugare a 450 x g per lavare la maggior parte dei batteri extracellulari. Infine, risospendere le cellule in terreno RMPI 10% FBS (senza antibiotici) a 20 x 10⁶ cellule/ml.

2. Isolamento dei linfociti T CD4⁺ da topi transgenici OTIINota: la Figura 1 riassume questo secondo passaggio. I linfonodi dovrebbero essere usati al posto della milza per isolare le cellule T CD4⁺ , perché la proporzione di linfociti CD4⁺ nei linfonodi (~50%) è maggiore rispetto alla milza (~25%) e quindi la purificazione sarebbe più efficace.

Fare una sospensione unicellulare dei linfonodi
1. Rimuovere i linfonodi inguinali, ascellari, brachiali, cervicali e mesenterici dai topi transgenici OTII e trasferirli in un piatto di plastica con 10 ml di terreno RPMI 10% FBS.
2. Macinare i linfonodi sotto una cappa sterile utilizzando due vetrini da microscopio smerigliati. Posizionare i linfonodi su un lato smerigliato di un vetrino da microscopio e strofinare con il lato smerigliato del secondo vetrino fino a quando gli organi non sono stati macinati.
3. Lavare la sospensione a cellula singola in tampone PBS/BSA/EDTA.
4. Filtrare le cellule attraverso un colino cellulare (70 μm) per rimuovere il tessuto connettivo e lavare con tampone PBS/BSA/EDTA.
5. Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi ACK e incubare per 1 minuto a RT per eliminare i globuli rossi.
Isolamento delle cellule T CD4⁺
1. Lavare nuovamente come al punto 2.1.3 e contare le cellule per risospenderle a 100 x 10⁶ cellule/ml in tampone PBS/BSA/EDTA. Aggiungere anticorpi biotinilati contro CD8, IgM, B220, CD19, MHC classe II (I-Ab), CD11b, CD11c e DX5 a 1:250 per 30 minuti su ghiaccio per la successiva selezione negativa delle cellule T CD4⁺ .
2. Lavare le cellule in tampone PBS/BSA/EDTA e incubare le cellule (100 x 10⁶ cellule/ml) con microsfere di streptavidina alla concentrazione raccomandata nel protocollo del produttore per 15 minuti su ghiaccio.
3. Lavare le cellule in tampone PBS/BSA/EDTA e filtrarle attraverso un filtro cellulare (30 μm) prima dell'isolamento delle cellule T CD4⁺ .
4. Isolare le cellule T CD4⁺ mediante selezione negativa utilizzando una macchina per la separazione magnetica delle cellule secondo il protocollo del produttore.
5. Contare le cellule e regolare a 4 x 10⁶ cellule/ml con terreno RPMI 10% FBS (senza antibiotici).
6. Fissare e conservare su ghiaccio le cellule T CD4⁺ isolate (3 x 10,⁵ cellule) per verificare la purezza con il citometro a flusso. Un esempio di purificazione delle cellule T CD4⁺ è mostrato nella Figura 3C.

3. Misurazione della transinfezione con cellule T mediante test di protezione della gentamicinaNota: la Figura 2 riassume questa terza fase del protocollo.

Transinfezione con cellule T

1. Incubare le cellule T CD4⁺ isolate con cellule DC infette (1:1) (le DC sono state infettate per 1 ora e lavate per eliminare i batteri liberi) per 30 minuti per consentire la formazione di sinapsi immunitarie in un incubatore di CO₂ (37 °C, 5% CO₂).

2. Aggiungere 0,5 ml di cellule T CD4⁺ isolate (2 x 10⁶ cellule) e 0,1 ml di DC infette (2 x 10⁶ cellule) su una piastra di coltura a 24 pozzetti. Come controllo negativo, infettare direttamente 0,5 ml di cellule T CD4⁺ con un MOI di 10 batteri per 30 minuti.

3. Includere controlli aggiuntivi che separino le DC infette dalle cellule T utilizzando una barriera transwell in policarbonato (con 3 μm di dimensione dei pori), impedendo il contatto fisico DC-T. Aggiungere 0,1 ml di DC all'interno del pozzetto e 0,5 ml di cellule T CD4⁺ nel compartimento inferiore del pozzetto (piastra a 24 pozzetti).

4. Infine, completare con il terreno RMPI fino a quando non ci sono 0,6 ml in ciascun pozzetto per ottenere volumi uguali in tutti i campioni.

5. Dopo 30 minuti di formazione delle sinapsi immunitarie, aggiungere 100 μg/ml di gentamicina e incubare per 1 ora prima di raccogliere le cellule in un incubatore di CO₂ (37°C, 5% CO₂).

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Risultati

Figura 1. Diagramma di flusso della generazione di CC e isolamento delle cellule T CD4⁺ . Sul lato sinistro della figura, è dettagliato il processo per differenziare le cellule dendritiche (DC) dalle cellule del midollo osseo. Dop...