Saggio di fototassi di cianobatteri filamentosi mediante illuminazione a luce focalizzata

Abstract

Fonte: Weber, N. et. al., Trasformazione naturale, espressione proteica e crioconservazione del cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra un test focalizzato basato su LED per lo studio della fototassi nei cianobatteri filamentosi. I batteri migrano verso la sorgente luminosa, formando un denso accumulo al centro illuminato, che viene visualizzato e quantificato attraverso l'analisi dell'intensità dei pixel dell'immagine acquisita.

Protocollo

1. Dosaggio per fototassi
   1. Per gli esperimenti di fototassi preparare i portadiodi a emissione luminosa (LED) (qui, con una stampante 3D) in cui i LED da 5 mm selezionati sono montati per irradiare un'area di 20 mm² dal basso verso l'alto (Figura 1). Se necessario, utilizzare più supporti LED in parallelo, collegando elettricamente ogni LED tramite un resistore e un potenziometro a un alimentatore regolabile. Misurare e regolare l'intensità dei LED, a seconda dell'esperimento. Assicurati che l'intero ambiente si trovi in una stanza buia o in un contenitore chiuso e buio.
   2. Introdurre 8 ml di terreno contenente Phormidium lacuna in una capsula di Petri di 6 cm. Regolare l'intensità della luce del LED. Chiudere la piastra di Petri con il coperchio e posizionarla su un supporto LED in modo che il LED si trovi al centro della piastra di Petri.
   3. Dopo la durata desiderata (in genere 2 giorni), catturare un'immagine della capsula di Petri con la fotocamera di uno smartphone puntata direttamente sulla posizione del trattamento con la luce. Utilizzare un pannello LED bianco per l'irradiazione del campione. Utilizzare le impostazioni manuali della fotocamera; evitare i riflessi di luce; Regolare sempre per ottenere la stessa distanza tra l'obiettivo della fotocamera e il campione. Assicurarsi che le impostazioni di esposizione forniscano un'immagine adatta per analisi successive utilizzando ImageJ.
   4. Quantifica il diametro del cerchio centrale dei filamenti utilizzando il software ImageJ.
      1. Apri ImageJ, fai clic su File | Apri, seleziona il file desiderato e fai clic su Invio.
      2. Seleziona il pulsante Dritto (con una linea retta). Premere il pulsante sinistro del mouse per tracciare una linea da un'estremità della capsula di Petri all'estremità opposta. Assicurarsi che la linea passi attraverso il centro del cerchio di filamenti.
      3. Premere Ctrl-K sulla tastiera o fare clic su Analizza | Profilo di stampa nel menu ImageJ. Cerca una finestra x-y con l'intensità dei pixel tracciata rispetto alla distanza: un profilo 1D della capsula di Petri. Assicurati che l'intensità minima dei pixel sia leggermente superiore a 0 e che il valore più alto sia inferiore a 255.
      4. Stimare un valore medio per l'intensità dei pixel all'esterno del cerchio e un altro valore medio per l'intensità dei pixel nel cerchio. Nella posizione y tra questi valori, stimare i valori x di entrambi i lati del cerchio puntando con il mouse su queste posizioni. Annotare entrambi i valori e calcolare la differenza.
      5. Ottenere il valore x più alto puntando il mouse sull'asse y a destra. Si noti che questo valore e rappresenta il diametro della piastra di Petri. Se questo diametro è di 5 cm, calcolare il diametro del cerchio centrale del filamento come d/e × 5 cm.

Risultati

Figura 1: Esperimento di fototassi A sinistra: supporto LED con 4 LED rossi, collegato ad un alimentatore regolabile. Sopra ogni LED, c'è una piastra di Petri da 6 cm con 8 mL di coltura di Phormidium lacuna. A destra: piastra di Petri con P. lacuna dopo ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di Petri polistirolo, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Fotometro Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotecnologie
Fotometro Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 10-100 μL	Gilson	SKU: FA10004M
software, URL
ImmagineJ		Software per l'elaborazione delle immagini (intensità dei pixel, diametro del cerchio)
Terreni di coltura
f/2 -liquido medio	acqua di mare artificiale, soluzione di oligoelementi allo 0,1 % (v/v), soluzione vitaminica allo 0,05 % (v/v), nitrato di sodio 0,88 mM, fosfato monosodico 36 μM