Valutazione dell'attaccamento pneumococcico alle cellule endoteliali umane primarie in costante flusso di terreno

Abstract

Fonte: Jagau, H. et al. Infezione da pneumococco di cellule endoteliali umane primarie a flusso costante. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra la visualizzazione in tempo reale dell'attaccamento pneumococcico alle stringhe del fattore di Von Willebrand (VWF) su cellule endoteliali in condizioni di flusso costante del terreno. Descrive i passaggi per stimolare il rilascio di VWF, etichettare le stringhe e quantificare il legame batterico.

Protocollo

1. Induzione del rilascio del fattore di Von Willebrand (VWF) e visualizzazione di stringhe VWF multimerizzate

1. Mantenere l'impostazione del flusso perché è necessaria una sollecitazione di taglio di 10 dyn/cm² per innescare la multimerizzazione del VWF in stringhe lunghe fino a 200 MDa. Indurre il rilascio di VWF dal WPB endoteliale iniettando 136 μL di una soluzione madre di istamina da 100 mM nel terreno di crescita delle cellule endoteliali con miscela di integratori (ECGMS)-terreno circolante nel tubo di perfusione utilizzando una porta di iniezione. La concentrazione finale di istamina nel mezzo di flusso sarà di 1 mM. Se non è disponibile alcuna porta di iniezione, l'istamina può essere aggiunta in alternativa pipettandola nel mezzo dei serbatoi della pompa.
2. Per la rilevazione in immunofluorescenza di stringhe VWF multimerizzate, interrompere il flusso quando viene raggiunto un livello bilanciato del mezzo nei serbatoi e iniettare 20 μg di un anticorpo coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) specifico per VWF in un volume di 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4) nei 13,6 mL circolanti di terreno ECGMS utilizzando una porta di iniezione. Se non è disponibile alcuna porta di iniezione, l'anticorpo può essere aggiunto in alternativa pipettandolo nel mezzo dei serbatoi della pompa. Ciò si traduce in una concentrazione finale di anticorpi di 1,3 μg/mL.
3. Per la scansione microscopica di diversi campi visivi in breve tempo, utilizzare l'unità di fluorescenza del microscopio con un dispositivo a fluorescenza allo xeno al 30% di potenza e una fotocamera a epifluorescenza. Monitora la forma e la morfologia dello strato di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) con la modalità campo chiaro per selezionare cellule rappresentative adatte alla visualizzazione delle stringhe VWF.
4. Per la visualizzazione delle stringhe VWF fluorescenti verdi, selezionare un obiettivo dell'olio 63x/1,40 e un filtro di rilevamento da 470 nm nel menu dell'unità di fluorescenza del software del microscopio (LasX). Crea istantanee di Z-stack di almeno 50 viste di campo rappresentative, ciascuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatti. Per quantificare le stringhe VWF fluorescenti verdi in diversi punti temporali, scansionare diversi campi visivi.

2. Valutazione microscopica dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF in flusso in tempo reale

1. Quantificare l'attaccamento pneumococcico alle stringhe VWF generate sulle superfici cellulari HUVEC tramite rilevamento in immunofluorescenza.
   1. Trattenere il flusso e iniettare 1,35 x 10⁸ CFU/mL di pneumococchi che esprimono la proteina a fluorescenza rossa (RFP) in un volume massimo di 1 mL nel terreno ECGMS utilizzando la porta di iniezione. In alternativa, pipettare i batteri nel fluido nel serbatoio della pompa. Riavviare lo sforzo di taglio a 10 dyn/cm² per far circolare i batteri all'interno del sistema di pompaggio.
   2. Selezionare un obiettivo a immersione in olio 63x per l'ingrandimento del microscopio e regolare le impostazioni del filtro a fluorescenza nel software del microscopio sul canale RFP (filtro di rilevamento da 540 nm) per il rilevamento di pneumococchi che esprimono RFP.
   3. Per quantificare l'attaccamento batterico alle stringhe VWF, arrestare il flusso e creare istantanee di pile Z di almeno 30 viste di campo rappresentative, ciascuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatti, e contare il numero di pneumococchi.
   4. Utilizzare l'algoritmo di statistica monofattoriale ANOVA per valutare i dati, seguito da un test a campione non accoppiato a due code post hoc per un confronto statistico dettagliato. I valori di P di <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Materiali