Imaging a fluorescenza dell'infezione batterica associata a biomateriale in embrioni di zebrafish

Abstract

Fonte: Zhang, X., et al. Un modello di embrione di pesce zebra per la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale dell'infezione da Staphylococcus aureus associata a biomateriali. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'imaging a fluorescenza di embrioni di zebrafish iniettati con Staphylococcus aureus, consentendo la quantificazione della progressione dell'infezione e della distribuzione batterica per valutare l'impatto delle microsfere di biomateriali sulle interazioni ospite-patogeno in vivo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Microscopia a fluorescenza della progressione dell'infezione e dell'infiltrazione cellulare provocata in embrioni di zebrafish

1. Anestetizzare gli embrioni mettendoli in una capsula di Petri da 100 mm contenente lo 0,02% (p/v) di acido 3-amminobenzoico (Tricaina) per anestetizzarli. Dopo 5 minuti, trasferire gli embrioni nella piastra di agarosio ricoperta di terreno E3 contenente lo 0,02% (p/v) di tricaina e allinearli in un unico orientamento per l'iniezione. Pipettare 500 μl di una soluzione di metilcellulosa PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) -2% (wt) in una piastra di Petri contenente terreno E3 con tricaina allo 0,02% (p/v). Metti gli embrioni nella soluzione di metilcellulosa e mantienili dritti e orizzontali.
   NOTA: La soluzione di metilcellulosa viene utilizzata come "colla" che, a causa della sua viscosità, può immobilizzare temporaneamente gli embrioni nel miglior orientamento per l'imaging.
2. Utilizzare un microscopio a stereofluorescenza dotato di filtri a campo chiaro, mCherry, proteina fluorescente verde (GFP) e filtri UV (ultravioletti) per visualizzare i singoli embrioni con impostazioni ottimizzate identiche (ad esempio, intensità, guadagno e tempo di esposizione) con ingrandimento 160x. Impostare il piano focale in modo tale che il danno tissutale causato dall'iniezione sia a fuoco, utilizzando il filtro a campo chiaro. Impostare la profondità Z-stack a 10 μm e la dimensione del passo a 5 μm, il che consente la registrazione di 3 immagini consecutive.
3. Immagine dei singoli embrioni una volta al giorno da 5 ore dopo l'iniezione fino a 2 giorni dopo l'iniezione. Escludere gli embrioni morti (nessun battito cardiaco o embrione parzialmente degradato) per ulteriori immagini e analisi. Mantenere gli embrioni individualmente in terreno E3 in piastre a 48 pozzetti. Aggiorna il terreno ogni giorno.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microsfere di polistirene diametro 10 μm (fluorescente blu)	Tecnologia della vita/ThemoFisher	F8829
Acido 3-amminobenzoico (Tricaina)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Microscopio stereofluorescente LM80	Leica	MDG3610450126
Metilcellulosa 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Capsula di Petri	Falcone	353003
Capsula di Petri	Biomerieux	NL-132
ImmagineJ	Non applicabile	Non applicabile	Collegamento: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0	Prisma	Non applicabile