Analisi in vivo delle infezioni batteriche associate all'impianto utilizzando embrioni di zebrafish

Abstract

Fonte: Zhang, X. et. al., Un modello di embrione di pesce zebra per la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale dell'infezione da Staphylococcus aureus associata a biomateriali. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un modello di embrione di zebrafish per lo studio delle infezioni legate ai biomateriali impiantati. L'iniezione di Staphylococcus aureus con microsfere di polistirene migliora la sopravvivenza batterica, confermando il ruolo di promozione delle infezioni dei materiali impiantati.

Protocollo

1. Preparazione di sospensioni di soli batteri e microsfere di batteri

NOTA: Viene utilizzato il ceppo Staphylococcus aureus RN4220 che esprime la proteina fluorescente mCherry (S. aureus-mCherry). Il ceppo RN4220 di S. aureus è mutato nel gene regolatore di virulenza agrA (regolatore genico accessorio A) e, pertanto, può avere una virulenza relativamente bassa nel modello di embrione di zebrafish. Possono essere utilizzati altri ceppi di S. aureus o altre specie batteriche per l'infezione associata a biomateriali (BAI).

Prelevare da 4 a 5 colonie di batteri S. aureus RN4220 da piastre di coltura di agar di soia triptica integrate con 10 μg/mL di cloramfenicolo e coltivare i batteri fino alla fase di crescita medio-logaritmica in 10 mL di brodo di soia triptico integrato con 10 μg/mL di cloramfenicolo a 37 °C sotto agitazione.
1. Durante la coltura, diluire 100 μl della sospensione batterica in 900 μl di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in una cuvetta (larghezza di 1 cm) per una misurazione della densità ottica (OD) a 620 nm (OD₆₂₀). Coltiva i batteri fino a quando l'OD₆₂₀ raggiunge 0,4-0,8.
  NOTA: Un OD₆₂₀ di 0,1 corrisponde generalmente a 3,0 x 10⁷ unità formanti colonie (CFU)/mL di S. aureus. L'OD₆₂₀ di un inoculo di batteri nella fase di crescita medio-logaritmica è compreso tra 0,4 e 0,8. Periodi di tempo diversi per la coltura possono essere necessari per altre specie e ceppi di batteri.
Centrifugare i batteri a 3.500 x g per 10 minuti e risospendere i batteri pellettati in 1 mL di PBS sterile. Successivamente, lavare i batteri con PBS sterile 2 volte e infine risospendere i batteri in 1,1 mL di soluzione di polivinilpirrolidone40 (PVP40) al 4% (p/v) in PBS.
Agitare questa sospensione batterica e diluire 100 μL della sospensione in 900 μL di PBS sterile in una cuvetta per la misurazione OD₆₂₀ . Regolare la concentrazione della sospensione batterica con la soluzione PVP40. Questa è la sospensione "Solo batteri".
I biomateriali possono essere scelti liberamente per essere miscelati con la sospensione batterica. Nel presente studio vengono utilizzate microsfere commerciali di polistirene (PS) (fluorescenti blu, 10 μm). Per generare una sospensione batterico-microsfere, centrifugare le microsfere per 1 minuto a 1.000 x g, temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere le microsfere nella sospensione "solo batteri" (in soluzione PVP40).
Per iniettare dosi approssimativamente uguali di batteri in presenza e in assenza di microsfere, la concentrazione della sospensione Batteri-Microsfere deve essere pari a due terzi della concentrazione della sospensione "Solo batteri" (senza microsfere). Ciò si ottiene diluendo la sospensione Batteri-Microsfere con 0,5 volumi di soluzione PVP40. Mescolare le sospensioni mediante vortex. Da notare che questo rapporto (due terzi) è stato valutato per S. aureus. È appropriato anche per S. epidermidis, ma si consiglia di verificare se questo rapporto si applica anche ad altre specie batteriche e ad altre dimensioni (oltre a 10 μm) o forme di biomateriali (oltre alle microsfere) da iniettare.
Controllare la concentrazione della sospensione "Solo batteri" e Batteri-Microsfere mediante coltura quantitativa di diluizioni seriali di 10 volte come indicato di seguito: trasferire 100 μL delle sospensioni in una piastra da 96 pozzetti e diluire in serie trasferendo 10 μL di aliquote della sospensione in 90 μL di PBS sterile. Duplicare su piastra aliquote da 10 μl di sospensioni non diluite e diluite su piastre di agarosio, incubare le piastre a 37 °C per una notte, contare le colonie e calcolare il numero di batteri (unità formanti colonie, CFU).

2. Allevamento, raccolta e mantenimento di embrioni di pesce zebra

Seguire le procedure generali per l'allevamento, la raccolta e il mantenimento degli embrioni di zebrafish, con le modifiche descritte di seguito. Incrocia una famiglia di pesci zebra a pinna lunga (TL) Tupfel di tipo selvatico o di pesci zebra della linea transgenica selezionata (qui, Mpeg1: Kaede) in una vasca con l'aggiunta di una rete per indurre le femmine adulte a produrre uova dopo l'accensione della luce, quindi separare gli adulti dalle uova prodotte.
Il giorno successivo, raccogli gli embrioni e scarta quelli non trasparenti, che non sono vitali. Conservare circa 60 embrioni per capsula di Petri (100 mm di diametro) in terreno E3 e incubare a 28 °C. Rimuovere gli embrioni morti e anomali e rinfrescare il terreno E3 ogni giorno.

3. Preparazione degli aghi per iniezione

Preparare gli aghi microcapillari di vetro per l'iniezione utilizzando uno strumento estrattore per micropipette. Utilizzare le seguenti impostazioni: calore: 772, trazione: 100, vel: 200, tempo: 40, gas: 75.
Rompere la punta dell'ago con una pinza nella posizione in cui l'ago ha un diametro esterno di circa 20 μm (per microsfere da 10 μm), utilizzando un microscopio ottico con una barra graduata nell'oculare. Evita gli aghi con un'apertura molto grande, poiché comprometterebbero la sopravvivenza degli embrioni.
NOTA: L'apertura può essere scelta in modo più piccolo o più grande, a seconda delle dimensioni e della forma dei biomateriali da iniettare. In letteratura, è stato riportato che le iniezioni con aghi con un'apertura di circa 50 μm causano una significativa diminuzione della sopravvivenza dell'embrione.

4. Iniezione di sospensione di soli batteri o microsfere batteriche in embrioni di zebrafish

Scaldare la soluzione di agarosio (1-1,5% (in peso) in semi-acqua) utilizzando un forno a microonde e versarla in una capsula di Petri da 100 mm. Posizionare un modello di stampo di plastica sopra la soluzione di agarosio nella capsula di Petri per creare rientranze nell'agarosio per posizionare gli embrioni nelle posizioni corrette e facilitare le iniezioni. Incubare a temperatura ambiente e rimuovere lo stampo quando la soluzione di agarosio si è solidificata.
A 3 giorni dopo la fecondazione, posizionare gli embrioni in una capsula di Petri da 100 mm contenente lo 0,02% (p/v) di acido 3-amminobenzoico (tricaina) per anestetizzarli. Dopo 5 minuti, trasferire gli embrioni nella piastra di agarosio ricoperta di terreno E3 contenente lo 0,02% (p/v) di tricaina e allinearli in un unico orientamento per l'iniezione. Per la linea transgenica Mpeg1: Kaede anestetizzare prima gli embrioni in terreno E3 contenente lo 0,02% (p/v) di tricaina. Quindi, selezionare gli embrioni che esprimono proteine fluorescenti verdi utilizzando un microscopio a stereofluorescenza.
Caricare l'ago con circa 10 μL di sospensione "Solo batteri" o Batteri-Microsfere utilizzando un puntale per pipetta microcaricatore. Montare l'ago su un micromanipolatore collegato al microiniettore. Per l'iniettore qui utilizzato (vedi Tabella dei materiali), utilizzare le seguenti impostazioni per iniezioni di 2-3 nL: pressione: 300-350, contropressione: 0, tempo: 2 ms. NOTA: Le impostazioni per il microiniettore dipendono dall'iniettore utilizzato. Potrebbe essere necessario regolare le impostazioni dell'iniettore per le iniezioni di batteri mescolati con biomateriali di altre forme o dimensioni.
1. Utilizzare aghi con la stessa apertura per l'iniezione della sospensione "Solo batteri" e della sospensione Batteri-Microsfere. Se l'ago è rotto o ostruito, sostituirlo sempre con un ago nuovo per ulteriori iniezioni.
Inserire l'ago nel tessuto muscolare degli embrioni al microscopio ottico (Figura 1), con un angolo di 45-60° tra l'ago e il corpo degli embrioni. Regola la posizione dell'ago nel fazzoletto muovendolo delicatamente avanti e indietro. Iniettare gli embrioni utilizzando un pedale collegato al microiniettore.
Dopo l'iniezione di batteri fluorescenti, valutare gli embrioni per l'infezione riuscita con un microscopio a stereofluorescenza. Scartare gli embrioni con punteggio negativo (nessun batterio fluorescente visibile o nessuna microsfera fluorescente visibile). Mantenere gli embrioni individualmente in terreno E3 in piastre a 48 pozzetti. Aggiorna il terreno ogni giorno.

5. Frantumazione di embrioni, punteggio microscopico e coltura quantitativa di batteri

Valutare tutti gli embrioni al microscopio per la presenza di batteri fluorescenti utilizzando un microscopio a stereofluorescenza, a partire immediatamente dopo le iniezioni e ogni giorno successivo fino a quando gli embrioni non vengono selezionati casualmente per la coltura quantitativa.
Selezionare casualmente alcuni embrioni vivi infetti (da 5 a 6 nel presente studio) poco dopo l'iniezione e trasferirli individualmente in microprovette separate da 2 ml utilizzando puntali sterili. Rimuovere il terreno, lavare delicatamente gli embrioni con PBS sterile una volta e aggiungere 100 μL di PBS sterile.
Aggiungere 2-3 perle sterili di zirconia (2 mm di diametro) a ciascuna fiala e schiacciare gli embrioni utilizzando l'omogeneizzatore (vedi Tabella dei materiali) a 3.500 giri/min per 30 s. Coltivare quantitativamente l'omogeneizzato come descritto al punto 1.3.
NOTA: Altri omogeneizzatori possono richiedere impostazioni diverse.
Selezionare casualmente più embrioni nei giorni successivi all'iniezione per la coltura quantitativa secondo il passaggio 5.3.

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Risultati

Figura 1: Procedura schematica di co-iniezione di sospensione di Batteri-Microsfere nel muscolo della coda di embrioni di zebrafish.