Un metodo visivo sensibile per il rilevamento di batteri produttori di idrogeno solforato

Abstract

Fonte: Zhu, W., & Chu, W. Metodo visivo sensibile per il rilevamento di batteri produttori di idrogeno solforato. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra un metodo visivo sensibile per il rilevamento rapido dei batteri produttori di idrogeno solforato. Un cambiamento di colore dal giallo al nero indica l'attività batterica attraverso la formazione di solfuro di bismuto.

Protocollo

1. Ceppi batterici

NOTA: Per questo esperimento sono stati utilizzati nove ceppi standard, tra cui Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris e Klebsiella pneumoniae. Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris possono produrre H₂S.

1. Preparazione della coltura batterica
   1. Trasferire una colonia batterica di Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 e Klebsiella pneumoniae da una piastra di agar Luria-Bertani (LB) a 100 mL di terreno LB e coltura a 37 °C per 12-16 ore fino a quando la concentrazione batterica è di circa 1 x 10⁹ cellule/mL (come indicato da OD₆₀₀ = 1).
   2. Trasferire una colonia batterica di Fusobacterium nucleatum e Proteus vuigaris da piastre di agar con brodo di soia tripticasi (TSB) a 100 mL di terreno TSB e coltura a 37 °C in modo anaerobico per 24 ore fino a quando la concentrazione batterica è di circa 1 x 10⁹ cellule/mL (come indicato da OD₆₀₀ = 1).

2. Saggio di rilevamento H₂S

1. Test di produzione di idrogeno solforato
   1. Miscelare 100 μL di coltura batterica con 100 μL di soluzione di bismuto appena preparata (pH 8,0; 10 mM di cloruro di bismuto (III), 0,4 M di trietanolammina-HCl, 20 mM di piridossal 5-fosfato monoidrato, 20 mM di EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) e 40 mM di L-cisteina) nelle piastre per microtitolazione a 96 pozzetti e coltura per 20 minuti a 37 °C. Per ogni ceppo batterico, eseguire l'analisi in triplice copia.
   2. Dopo 20 minuti, controllare il cambiamento di colore. Se il colore della soluzione cambia da giallo chiaro a nero, ciò indica che il batterio è in grado di produrre H₂S. Ripetere questa misurazione 3 volte.
2. Sensibilità del metodo
   1. Determinare la sensibilità del metodo utilizzando diverse concentrazioni di idrosolfuro di sodio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0 mM, miscelato con una soluzione di BS (solfuro di bismuto).
   2. Determinare la presenza di HS⁻/S²⁻ osservando la formazione di un precipitato nero di BS. Assegna un punteggio al colore dei pozzetti utilizzando una scala visiva che va da nessuna produzione di colore (-) alla produzione di colore nero più scuro (++++++).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di bismuto (III)	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanchino Reagente Chimico Co., Ltd	60-00-4
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
L-cisteina	Amresco	52-90-4
Trietanolammina-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8
Idrosolfuro di sodio
Pipetta