Preparazione di un inoculo batterico unicellulare

1. Preparazione di inoculo unicellulare Mycobacterium marinum (Figura 1)

1. Scongelare il glicerolo fluorescente ceruleo Mycobacterium marinum a partire da -80 °C e inoculare una piastra di agar 7H10 con OADC al 10% (v/v) (acido oleico, albumina, destrosio, catalasi), glicerolo allo 0,25% e 50 μg/mL di igromicina. Incubare la piastra a 32 °C per circa 10 giorni.
2. Selezionare una colonia che esprime fluorescenza positiva e inoculare 3 mL di terreno 7H9 con il 10% di OADC, lo 0,5% di glicerolo e 50 μg/mL di igromicina.
   1. Incubare l'inoculo a 32 °C e 100 giri al minuto (rpm) per 4-6 giorni fino a quando la coltura raggiunge la fase logaritmica (OD₆₀₀ = 0,6-1,0).
   2. Subcoltura (1:100) in 30 mL di terreno 7H9 fresco con 10% di OADC, 0,5% di glicerolo, 0,05% di Tween-80 e 50 μg/mL fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge ~1,0.
      NOTA: A questo punto, si consiglia un passaggio di sottocultura per ottenere la massima qualità della cultura. Nella nostra esperienza, l'aggiunta del clone direttamente a un grande volume di terreno porterà alla formazione di grumi batterici.
3. Raccogliere le cellule di M. marinum come descritto di seguito.
   1. Centrifugare a 3.000 x g per 10 minuti per raccogliere il M. marinum sotto forma di pellet. Scartare tutto tranne 300 μl di surnatante e utilizzarlo per risospendere il pellet.
   2. Aggiungere 3 mL di terreno 7H9 con glicerolo al 10% per risospendere ulteriormente il pellet, quindi sonicare la sospensione in un bagno d'acqua a 100 W a 15 s ON, 15 s OFF per un totale di 2 min.
      NOTA: La sonicazione viene utilizzata per ottenere un omogenato a singola cellula per l'inoculo, che impedisce il blocco dell'ago per microiniezione.
4. Trasferire la sospensione batterica in una siringa da 10 ml e passarla attraverso un filtro da 5 μm per rimuovere i grumi.
5. Misurare la densità ottica (OD) della sospensione utilizzando uno spettrofotometro e diluirla a OD₆₀₀ = 1,0 con terreno 7H9 contenente il 10% di glicerolo. Dividere la sospensione in aliquote da 10 μL e conservare in congelatore a -80 °C per un uso futuro.
6. Confermare la concentrazione batterica dell'inoculo (ufc/mL) mediante diluizione seriale e placcatura del ceppo batterico su una piastra di agar 7H10 contenente il 10% (v/v) di OADC, lo 0,5% di glicerolo e 50 μg/mL di igromicina.

Figura 1: Diagramma schematico della preparazione di batteri unicellulari. Seguendo il processo descritto, sono stati generati stock di Mycobacterium marinum fluorescente a cellula singola.