Preparazione di un inoculo batterico unicellulare

Abstract

Fonte: Niu, L., et al., Visualizzazione della morte delle cellule litiche dei macrofagi durante l'infezione micobatterica negli embrioni di pesce zebra tramite microscopia intravitale. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra la preparazione di una sospensione a singola cellula di Mycobacterium marinum da una coltura in fase di tarda logaritmica per un uso coerente nei saggi di infezione e nelle applicazioni a valle.

Protocollo

1. Preparazione di inoculo unicellulare Mycobacterium marinum (Figura 1)

1. Scongelare il glicerolo fluorescente ceruleo Mycobacterium marinum a partire da -80 °C e inoculare una piastra di agar 7H10 con OADC al 10% (v/v) (acido oleico, albumina, destrosio, catalasi), glicerolo allo 0,25% e 50 μg/mL di igromicina. Incubare la piastra a 32 °C per circa 10 giorni.
2. Selezionare una colonia che esprime fluorescenza positiva e inoculare 3 mL di terreno 7H9 con il 10% di OADC, lo 0,5% di glicerolo e 50 μg/mL di igromicina.
   1. Incubare l'inoculo a 32 °C e 100 giri al minuto (rpm) per 4-6 giorni fino a quando la coltura raggiunge la fase logaritmica (OD₆₀₀ = 0,6-1,0).
   2. Subcoltura (1:100) in 30 mL di terreno 7H9 fresco con 10% di OADC, 0,5% di glicerolo, 0,05% di Tween-80 e 50 μg/mL fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge ~1,0.
      NOTA: A questo punto, si consiglia un passaggio di sottocultura per ottenere la massima qualità della cultura. Nella nostra esperienza, l'aggiunta del clone direttamente a un grande volume di terreno porterà alla formazione di grumi batterici.
3. Raccogliere le cellule di M. marinum come descritto di seguito.
   1. Centrifugare a 3.000 x g per 10 minuti per raccogliere il M. marinum sotto forma di pellet. Scartare tutto tranne 300 μl di surnatante e utilizzarlo per risospendere il pellet.
   2. Aggiungere 3 mL di terreno 7H9 con glicerolo al 10% per risospendere ulteriormente il pellet, quindi sonicare la sospensione in un bagno d'acqua a 100 W a 15 s ON, 15 s OFF per un totale di 2 min.
      NOTA: La sonicazione viene utilizzata per ottenere un omogenato a singola cellula per l'inoculo, che impedisce il blocco dell'ago per microiniezione.
4. Trasferire la sospensione batterica in una siringa da 10 ml e passarla attraverso un filtro da 5 μm per rimuovere i grumi.
5. Misurare la densità ottica (OD) della sospensione utilizzando uno spettrofotometro e diluirla a OD₆₀₀ = 1,0 con terreno 7H9 contenente il 10% di glicerolo. Dividere la sospensione in aliquote da 10 μL e conservare in congelatore a -80 °C per un uso futuro.
6. Confermare la concentrazione batterica dell'inoculo (ufc/mL) mediante diluizione seriale e placcatura del ceppo batterico su una piastra di agar 7H10 contenente il 10% (v/v) di OADC, lo 0,5% di glicerolo e 50 μg/mL di igromicina.

Risultati

Figura 1: Diagramma schematico della preparazione di batteri unicellulari. Seguendo il processo descritto, sono stati generati stock di Mycobacterium marinum fluorescente a cellula singola.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,05% Interpolazione-80	Sigma	P1379
Siringa da 10 ml	Distretto di Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
Filtro da 5 μm	Mille X	SLSV025LS
50 μl/ml di igromicina	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
Camera Ambientale	Pecon	Regolazione della temperatura 37-2 digitale
Microloader Eppendorf	Eppendorf	n.5242956003
Glicerolo	Sangon Biotech	A100854
Incubatrice	A chiglia	PH-140(A)
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
Sonicatore	SCICNTZ	JY92-IIDN
Spettrofotometro (OD600)	Eppendorf AG	22331 Amburgo