Ottenimento di amiloidi citotossici a seguito di infezione batterica delle cellule endoteliali polmonari di ratto

In questo articolo

Abstract

Fonte: Balczon, R., et al. Metodi per rilevare gli amiloidi citotossici a seguito di infezione delle cellule endoteliali polmonari da parte di Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra la procedura per generare surnatante citotossico da cellule endoteliali polmonari in seguito all'infezione da Pseudomonas aeruginosa. Delinea come le proteine effettrici batteriche interrompono la struttura della cellula ospite e inducono il rilascio di oligomeri amiloidi citotossici nel surnatante.

Protocollo

Generazione di surnatanti citotossici:

Le colture primarie di cellule endoteliali microvascolari polmonari di ratto (PMVEC) sono state ottenute dalla Cell Culture Core Facility presso il Center for Lung Biology dell'Università del Sud Alabama.

Per la generazione di surnatanti citotossici, impiattare 2 x 10⁶ cellule in singole piastre da 150 cm e far crescere per 3 - 4 giorni fino a raggiungere la confluenza. Usa due piastre per esperimento.
Per produrre surnatante, lavare una delle due piastre da 150 cm di PMVEC con soluzione salina tamponata con fosfato, tripsinizzare e quindi contare le cellule. Lavare l'altro piatto di PMVEC con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e quindi infettare con entrambi i ceppi di Pseudomonas aeruginosa a una molteplicità di infezione (MOI) di 20:1. Ciò si ottiene come segue:
1. Per P. aeruginosa, OD₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ CFU/mL. Per preparare questa diluizione, aggiungere 1 mL di HBSS a una cuvetta monouso da 1 mL. Raschiare una quantità sufficiente di batteri dalla piastra fino a raggiungere un OD₅₄₀ di 0,25 quando misurato con uno spettrofotometro. Il prossimo passo fornirà un calcolo della quantità di batteri necessari.
2. Una volta determinato il numero di PMVEC nella piastra di coltura, determinare il numero appropriato di batteri da aggiungere alla seconda piastra di coltura non tripsinizzata contenente le PMVEC. Ad esempio, se si determina che la piastra di coltura di PMVEC contiene 1,3 x 10⁷ cellule, preparare 1,3 x 10⁷ cellule x 20 batteri/cellula x 1 mL/2 x 10⁸ CFU = 1,3 mL di batteri.
3. Diluire 1,3 mL di batteri in HBSS fino a un volume finale di 20 mL, in modo che l'intera superficie di una piastra di 150 cm possa essere ricoperta di liquido, quindi aggiungere i batteri diluiti alla piastra di PMVEC.
4. Incubare le PMVEC inoculate con i batteri a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂per 4 - 5 ore, fino a quando non si possono vedere le lacune formarsi nel monostrato cellulare quando la piastra viene osservata al microscopio (vedere la Figura 1 per il corretto livello di formazione delle lacune).
5. Raccogliere il surnatante, quindi centrifugare per 10 minuti a 2.000 x g in una centrifuga da tavolo per rimuovere i detriti cellulari.
  Nota: Per questa fase è possibile utilizzare qualsiasi centrifuga da tavolo in grado di generare una forza g sufficiente per pellettare celle non lessete e frammenti di cellule di grandi dimensioni.
6. Versare il surnatante in una siringa con un filtro da 0,2 μm attaccato all'estremità, quindi passare il surnatante attraverso il filtro per rimuovere i batteri.
7. Utilizzare un'aliquota del surnatante sterile per testare la citotossicità e congelare il resto del surnatante a -80 °C per un uso futuro.

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Risultati

Figura 1. Effetti dell'inoculazione di P. aeruginosa sulla morfologia del PMVEC. Un monostrato confluente di PMVEC prima (A) e quattro ore dopo l'aggiunta (B) del ceppo PA103 di P. aeruginosa. Le lacune possono essere chiaramente ...