L'introduzione di un gene di interesse in una cellula è un metodo potente per chiarire la sua funzione in vivo. Questo protocollo descrive un metodo efficace di trasfezione di una cultura dei diritti umani neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs) con l'apparecchiatura di Nucleofector elettroporazione fatta da Amaxa.
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Articolo metodologico
Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trasfezione di cellule primarie neurale dei mammiferi, come umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), con reagenti comunemente usati lipidi cationici transfezione ha spesso portato la vitalità delle cellule poveri e bassa efficienza di trasfezione. Altri metodi meccanici di introdurre un gene di interesse, come ad esempio una pistola gene o microiniezione, sono anche limitato dalla scarsa vitalità delle cellule e basso numero di cellule transfettate. La strategia di usare costrutti virali per introdurre un gene esogeno in cellule primarie è stata limitata sia dalla quantità di tempo e lavoro necessari per creare vettori virali e di potenziali problemi di sicurezza. Descriviamo qui un passo-passo protocollo per la trasfezione hNSPCs utilizzando un dispositivo Nucleofector Amaxa e la tecnologia con parametri elettrici corrente e soluzioni tampone specificamente ottimizzato per trasfezione delle cellule staminali neurali. Usando questo protocollo, abbiamo raggiunto l'efficienza di transfezione iniziale del ~ 35% ~ 70% e dopo trasfezione stabile. Il protocollo prevede che combina un elevato numero di hNSPCs con il DNA per essere transfettate nel buffer appropriato seguito da elettroporazione con il dispositivo Nucleofector.
Protocollo
Nota: Fare riferimento all'articolo Passaging neurali Cellule staminali umane ( https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) e il conteggio umani articolo Neural Stem Cells ( https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) per imparare a risospendere e contare hNSPCs.
Preparazione
- Assicurarsi che ci sono un sacco di cellule disponibili per la trasfezione (diversi milioni di cellule per ogni DNA da transfettate).
- Cappotto di una cultura di tessuto piatto, in cui le cellule transfet....
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Discussione
Questo protocollo descrive una procedura di trasfezione relativamente rapido ed efficiente per hNSPCs. Utilizzando questa procedura, abbiamo ottenuto l'efficienza di transfezione iniziale del ~ 35%. Cellule transfettate con questa procedura può essere utilizzata per studi a breve termine (cellule trasfettate transitoriamente) o per studi a lungo termine se un agente di selezione viene utilizzato per generare una popolazione stabilmente transfettate. Abbiamo generato cellule trasfettate stabilmente in cui circa il 70% delle cellule espri.......
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Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l'Ospedale dei Bambini s, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di culture hNSPC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Dispositivo Nucleofector | Strumento | Amaxa | AAD-1001 | |
| Kit Nucleofector per cellule staminali neurali di topo | Reagente | Amaxa | VPG-1004 |
Riferimenti
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A.
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Ristampe e permessi
