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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
- Inoculazione di animali con ceppi batterici per iniezione
- La mattina delle iniezioni, rimuovere i crioviali dei ceppi batterici in esame e scongelare a 4 °C per 3-4 ore. Scongelare 0,5 ml per ogni topo che verrà iniettato. Tenere i flaconcini sul ghiaccio dopo lo scongelamento e iniettare i topi entro 2 ore.
- Dopo lo scongelamento, trasferire ogni crioviale in una nuova provetta da 2 mL e centrifugare a 4.500 x g per 10 minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
- Centrifugare nuovamente a 4.500 x g per 10 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1x PBS fino a una concentrazione finale di 2,5 x 109 CFU/mL (CFU: unità formanti colonie). La quantità esatta di 1x PBS utilizzata varierà leggermente tra le varietà.
- Prelevare 3 campioni dalla sospensione finale di ciascun ceppo per convalidare CFU/mL, genotipo e fenotipo come descritto sopra.
- Per ogni ceppo, aliquotare 1,5 mL di PBS/sospensione cellulare in una provetta da 2 mL ogni 5 topi per limitare il numero di volte in cui la provetta viene inserita. Inoltre, preparare tubi da 1x PBS per le iniezioni di controllo.
- Raccogli i topi (10 maschi e 10 femmine C57BL/6 per gruppo per questo esperimento) e i materiali necessari per le iniezioni (siringhe, aghi, contenitori per oggetti taglienti, pennarelli, carta e penna, ecc.). Spostati nella sala chirurgica sterile per animali. Pulire tutte le superfici con salviette igienizzanti.
- Per eliminare l'angoscia e il rischio di lesioni per lo sperimentatore, portare in sala chirurgica solo un sesso e un gruppo sperimentale di topi alla volta (ad esempio, un gruppo di 10 topi maschi da infettare con un particolare ceppo). Indossare due paia di guanti in lattice per eliminare la perforazione dei guanti in caso di morso. Indossare camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e maschera facciale per evitare contaminazioni.
- Iniziare le iniezioni del gruppo di controllo con 1x PBS. In questo modo si accerta se la sola iniezione comporta effetti avversi.
- Rimuovi un topo dalla gabbia. Rimuovi solo un mouse alla volta.
- Pesare il topo e segnare la coda con un pennarello indelebile per monitorare la perdita di peso dopo l'iniezione.
- Aprire una nuova siringa da 1 ml e un ago da 27 G (utilizzare una siringa e un ago nuovi per ogni topo per eliminare la contaminazione) e iniettare 200 μl di 1x PBS sterile.
- Afferra il mouse dietro le orecchie usando il pollice e l'indice. Pizzica per creare una piega cutanea sulla nuca a cui aggrapparsi: una piega più stretta riduce il movimento del collo e il rischio di essere morsi durante l'iniezione. Fissa la coda nel palmo usando il mignolo per tenere il mouse piatto con poco movimento.
- Gira il mouse e inserisci l'ago con un angolo di 30° nella cavità peritoneale sul lato sinistro o destro della linea mediana. Sollevare leggermente l'ago una volta inserito per assicurarsi che sia stato inserito nell'area intraperitoneale e non negli organi. Iniettare lentamente il PBS e poi ritirare l'ago.
- Posizionare l'ago usato in un contenitore per oggetti taglienti a rischio biologico. Non riutilizzare la siringa o l'ago. Un bolo nel sito di iniezione è tipico.
- Dopo l'iniezione, spostare il topo in una gabbia separata.
- Ripetere la procedura con il mouse successivo. Dopo che tutti i topi di una gabbia sono stati iniettati, rimettili immediatamente nella loro gabbia originale.
- Dopo aver iniettato il gruppo di controllo, iniziare a iniettare sospensioni di ceppi da testare seguendo la stessa procedura.
- Iniettare 200 μl della sospensione cellulare. Quando si inizia con sospensioni cellulari di 2,5 x 109 CFU/mL, ogni topo riceve 5 x 108 CFU.
NOTA: Queste concentrazioni sono state ottimizzate con ricerche preliminari sugli animali per determinare le dosi letali di ciascun ceppo. Potrebbe essere necessario aggiustare il dosaggio per altri ceppi/specie.
- Una volta completate tutte le iniezioni, riporta i topi nella stanza dell'alloggio per alleviare l'angoscia. Pulire l'area di lavoro con salviette igienizzanti.
- Monitorare la mortalità degli animali dopo l'iniezione controllando le gabbie per i topi morti ogni 3 ore per 72 ore e ogni 12 ore per 10 giorni. Registra il peso dei topi ogni 12 ore per determinare la perdita di peso dovuta a malattia.