Generazione di ricombinanti a doppio crossover di Pseudomonas aeruginosa per la delezione genica mirata

Abstract

Fonte: Valentine, M. E., et al. Generazione di mutanti di delezione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello murino di infezione. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra la generazione di ricombinanti a doppio crossover in Pseudomonas aeruginosa utilizzando una strategia di delezione genica basata su plasmidi. Il processo prevede la selezione di batteri che ospitano un plasmide non replicativo integrato nel genoma tramite un singolo crossover e quindi l'induzione di un secondo evento di ricombinazione sotto selezione di saccarosio per asportare il plasmide. Il successo della ricombinazione a doppio crossover è confermato dalla perdita di resistenza agli antibiotici e dalla capacità di crescere su terreni contenenti saccarosio.

Protocollo

1. Identificazione di ricombinanti a doppio crossover di P. aeruginosa

1. Per ogni coltura in brodo, inoculare 10 μL di coltura su una piastra preriscaldata di PIA (Pseudomonas Isolation Agar) integrata con il 10% di saccarosio (senza glicerolo) e striatura per colonie isolate. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
2. Il giorno successivo, rimuovi le piastre dall'incubatrice e ispezionale per verificarne la crescita. Le colonie resistenti al saccarosio dovrebbero essere ricombinanti a doppio crossover (cioè, aver rimosso il plasmide dal cromosoma tramite un evento di ricombinazione tra l'altra regione omologa dell'inserto plasmidico e il cromosoma di P. aeruginosa ).
   1. Applicare almeno 20 colonie con stuzzicadenti sterili su piastre preriscaldate di: 1) PIA, 2) PIA integrato con il 10% di saccarosio (senza glicerolo) e 3) PIA integrato con 300 μg/mL di carbenicillina.
3. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
4. Rimuovere le piastre dall'incubatrice ed esaminarle per verificarne la crescita. I veri ricombinanti a doppio crossover saranno sensibili alla carbenicillina e resistenti al saccarosio (cioè, colonie che sono cresciute su PIA e PIA integrate con saccarosio, ma non sono cresciute su PIA integrata con carbenicillina).

Materiali