Preparazione e isolamento di spore di Streptomyces venezuelae da una coltura liquida

Abstract

Fonte: Schlimpert, S., et al. Imaging time-lapse a fluorescenza dell'intero ciclo di vita di S. venezuelae utilizzando un dispositivo microfluidico. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video dimostra la coltivazione e l'isolamento delle spore di Streptomyces venezuelae. Le spore, cellule dormienti che aiutano i batteri a sopravvivere allo stress, vengono prodotte durante la limitazione dei nutrienti e raccolte attraverso la centrifugazione. Il metodo garantisce una sospensione di spore pura, conservata a freddo, per applicazioni a valle.

Protocollo

1. Isolamento di spore fresche di Streptomyces venezuelae e preparazione di terreno di coltura esaurito

1. Inoculare 30 ml di terreno di estratto di maltosio-lievito-estratto di malto (MYM), integrato con 60 μl di soluzione di oligoelementi R2 (TE), con 10 μl di spore del ceppo SV60 [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. Per una crescita e una sporulazione costanti delle cellule, utilizzare un pallone deflettore o un pallone che contenga una molla per consentire un'aerazione sufficiente.
2. Celle di coltura per 35-40 ore a 30 °C e 250 giri/min.
3. Esaminare le cellule mediante microscopia a contrasto di fase a montaggio liquido. A questo punto saranno visibili frammenti miceliali e spore.
4. Centrifugare 1 ml di cellule in una centrifuga da tavolo a 400 x g per 1 minuto per pellettare il micelio e i frammenti cellulari più grandi.
5. Trasferire circa 300 μl di surnatante contenente una sospensione di spore in una nuova provetta da 1,5 ml e conservare in ghiaccio. Conservare il terreno di coltura rimanente
6. Diluire le spore 1:20 in MYM-TE (concentrazione finale: 0,5-5 x 10⁷ spore/ml) e tenerle in ghiaccio fino al momento del bisogno.
   NOTA: Sebbene non siano state comprese le condizioni esatte che scatenano la sporulazione negli Streptomyces , l'uso del terreno MYM-TE esaurito, compresi eventuali segnali extracellulari sconosciuti provenienti da una coltura sporulante, stimola la sporulazione.
7. Sterilizzare con filtro 10 ml del terreno di coltura rimanente per ottenere MYM-TE esaurito, privo di spore e frammenti miceliali. Utilizzare un filtro per siringa sterile da 0,22 μm e trasferire MYM-TE esaurito in una provetta sterile da 15 ml.
8. Conservare il MYM-TE esaurito preparato per alcuni giorni a 4 °C se si desidera condurre ulteriori esperimenti con condizioni di crescita simili.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Estratto di malto di malto di lievito (MYM)4 g di maltosio4 g di estratto di lievito10 g di estratto di maltoaggiungere 1 L H2O utilizzando il 50% di acqua di rubinetto e il 50% di acqua di osmosi inversa e integrare con 200 ml di soluzione di oligoelementi R2 per 100 ml dopo la sterilizzazione in autoclave			Terreno di sporulazione utilizzato per la coltura di Streptomyces venezuelae SV60
R2 Soluzione di oligoelementi (TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl 3-6H2O2 mg CuCl2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 ml H2OAutoclave e conservare a 4 °C			Aggiunta di 0,002 volumi a MYM
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Sigma	P4417-100SCHEDA	Utilizzato per riempire i pozzetti di ingresso delle corsie inutilizzate nelle piastre B04A al fine di preparare le piastre per lo stoccaggio a breve termine.
Filtri per siringhe da 0,22 μm	Satorius stedim	Codice 16532-K	Preparazione del MYM-TE esaurito