Imaging time-lapse a fluorescenza del ciclo di vita di Streptomyces venezuelae

Abstract

Fonte: Schlimpert, S. et al. Imaging time-lapse a fluorescenza del ciclo di vita completo di S. venezuelae utilizzando un dispositivo microfluidico. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra l'imaging time-lapse a fluorescenza dell'intero ciclo di vita del batterio Streptomyces venezuelae utilizzando un dispositivo microfluidico per visualizzare la germinazione, la crescita ifale e la sporulazione in tempo reale.

Protocollo

1. Impostazione del microscopio e del protocollo time-lapse

Nota: Questo metodo è stato implementato su un microscopio a campo largo invertito completamente motorizzato e automatizzato dotato di una fotocamera sCMOS, una lampada ad alogenuri metallici, un autofocus hardware, un supporto per tavolino per piastre a 96 pozzetti e una camera ambientale.

1. Preriscaldare la camera ambientale a 30 °C in anticipo per evitare problemi con l'autofocus dopo l'inizio dell'esperimento. Il tempo necessario dipende dalla camera climatica utilizzata, dal microscopio e dal sistema di riscaldamento. Inizia a riscaldare il sistema la notte prima dell'esperimento.
2. Accendere il microscopio e il software di automazione e controllo della microscopia. Utilizza un obiettivo a immersione in olio ad alta apertura numerica (NA) per una raccolta del segnale e una risoluzione spaziale ottimali, come un obiettivo DIC in olio 100X, 1,46 NA. Selezionare i filtri e gli specchi dicromatici appropriati per acquisire immagini di contrasto interferenziale differenziale (DIC) e immagini di fusioni di proteine giallo-fluorescenti e rosso-fluorescenti.
3. Posizionare una goccia di olio da immersione sull'obiettivo e aggiungere il fluido da immersione sul fondo della finestra di imaging sulla piastra microfluidica per migliorare la messa a fuoco cellulare durante l'acquisizione dell'immagine. Montare con cautela il dispositivo microfluidico sigillato sul tavolino del microscopio invertito. Assicurarsi che la piastra sia posizionata saldamente nel supporto del tavolino e non si sposti nel corso dell'esperimento.
4. Metti a fuoco la finestra di imaging della camera di coltura microfluidica utilizzando i marcatori di posizione incorporati per l'orientamento. Concentrarsi sulla parte più a sinistra della prima camera di flusso (etichettata "A") con la dimensione della trappola 5, corrispondente a un'altezza della trappola di 0,7 μm.
5. Nel software di microfluidica, le celle di carico dal pozzo di ingresso 8 a 4 psi per 15 sec. Controllare la densità cellulare nella camera di coltura spostando il tavolino attraverso la finestra di imaging. Se non sono state intrappolate spore, ripetere la fase di caricamento della cella o, in alternativa, aumentare la pressione e/o il tempo di caricamento fino a raggiungere la densità cellulare desiderata (1-10 spore per finestra di imaging con 2.048 x 2.048 pixel). Evitare di sovraccaricare la camera di coltura. Nota: Normalmente utilizziamo la trappola di misura 5 per l'imaging di Streptomyces, ma abbiamo ottenuto buoni risultati anche con le trappole di dimensioni 4 e 3.
6. Avviare il programma di flusso nel software di controllo e lasciare che la piastra microfluidica si equilibri termicamente per 1 ora nella fase del microscopio prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine.
7. Nel software di controllo del microscopio, impostare un'acquisizione multidimensionale per acquisire più immagini in più posizioni del tavolino nel tempo:
   1. Per il salvataggio automatico: specificare una directory per il salvataggio automatico dei file immagine.
   2. Per le impostazioni di illuminazione, determinare in anticipo le impostazioni di illuminazione ottimali per ogni costrutto specifico. Per l'esperimento descritto, utilizzare i seguenti tempi di esposizione: DIC 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec.
   3. Per Serie temporali: impostare una serie temporale per acquisire immagini in sequenza nei punti temporali desiderati. Per l'imaging del ciclo di vita di S. venezuelae, selezionare un intervallo di tempo di 40 minuti su un periodo di 24 ore.
   4. Per le posizioni del tavolino e la messa a fuoco automatica: eseguire la scansione della camera di coltura spostando il tavolino e memorizzare le posizioni del tavolino per ogni posizione di imaging di interesse. Assicurarsi che le posizioni monostadio siano sufficientemente distanti tra loro per ridurre al minimo il fotosbiancamento e la fototossicità. In genere, utilizzare fino a 12 posizioni. Eseguire la routine di messa a fuoco automatica per ogni punto temporale per correggere la lenta deriva focale. Se disponibile nel software di controllo del microscopio, impostare la strategia di messa a fuoco automatica su "aggiornamento della superficie locale tramite autofocus hardware". Una volta verificate le coordinate Z delle posizioni del palco selezionate, attivare l'autofocus hardware.
8. Avviare l'esperimento time-lapse nel software di controllo del microscopio.
9. Verificare che tutte le posizioni del palco siano ancora a fuoco nei punti successivi. Per gli esperimenti time-lapse che durano diverse ore, osserviamo occasionalmente una deriva dello stadio anche quando si utilizza l'autofocus. Se è necessario rimettere a fuoco le posizioni del tavolino, interrompere l'esperimento in un momento appropriato, regolare la messa a fuoco e riavviare l'esperimento entro l'intervallo di tempo di imaging definito.
10. Interrompere l'acquisizione dell'immagine dopo 24-30 ore o quando le ife nella regione di interesse si sono differenziate in spore. Quindi, arrestare il programma di flusso nel software e smontare il dispositivo microfluidico.
11. Preparare la piastra microfluidica usata per la conservazione a breve termine. Rimuovere i terreni rimanenti dal pozzetto 1 al pozzetto 6, svuotare il pozzetto di scarto 7 e il pozzetto di caricamento delle celle 8. In condizioni sterili, riempire nuovamente i pozzetti usati della corsia "A" e i pozzetti delle corsie inutilizzate ("B" a "D") sulla piastra con soluzione fisiologica tamponata con fosfato sterile (PBS). Sigillare la piastra con parafilm per evitare che si secchi e conservare a 4 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
B04A CellAsic Piastra ONIX per cellule batteriche	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	Piastre di coltura microfluidica
Sistema di perfusione microfluidica CellAsic ONIX e ONIX FG (versione 5.0.2)	Merck-Millipore	EV-262	L'ultima edizione di ONIX (luglio 2015) e le istruzioni su come utilizzare il programma sono disponibili qui: http://www.merckmillipore.com
Microscopio Axio Observer.Z1	Zeiss	431007-9902-000	Microscopio a campo largo invertito completamente automatizzato e motorizzato
Incubatrice XL multi S1 con modulo di temperatura S1 e unità di riscaldamento XL S2	Zeiss	411857-9061-000	Camera ambientale che circonda il microscopio
Obiettivo Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Fotonica K.K.	C11440-22CU
Illuminatore HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
Set di filtri FL 46 HE YFP senza cambio	Zeiss	489046-9901-000	Set di filtri fluorescenti, eccitazione 500/25 nm, emissione 535/30 nm
Set di filtri FL 63 HE RFP senza spostamento	Zeiss	489063-0000-000	Set di filtri fluorescenti, eccitazione 572/25 nm, emissione 629/30 nm
Telaio di montaggio K-M per piastre multipozzetto	Zeiss	000000-1272-644	Supporto tavolino per piastra microfluidica
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	Software di controllo del microscopio
Modulo ZEN Time Lapse	Zeiss	410136-1031-110	Modulo software per l'impostazione di esperimenti di microscopia time-lapse
Modulo ZEN Riquadri/Posizioni	Zeiss	410136-1025-110	Modulo software per il salvataggio di specifiche posizioni del palco (xzy)
Figi	pacchetto software open source	http://fiji.sc/Fiji	Generazione di filmati time-lapse
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Sigma	P4417-100SCHEDA	Utilizzato per riempire i pozzetti di ingresso delle corsie inutilizzate nelle piastre B04A al fine di preparare le piastre per lo stoccaggio a breve termine.
SV60	Collezione di ceppi del John Innes Centre		Ceppo di S. venezuelae che esprime divIVA-mcherry e ftsZ-ypet