Comportamento di sciamatura di Pseudomonas aeruginosa sotto stress antibiotico

Abstract

Fonte: Bru, J., et al., Imaging time-lapse di sciami batterici e risposta collettiva allo stress. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la procedura per analizzare il comportamento di sciamatura di Pseudomonas aeruginosa osservando la crescita batterica da una coltura centrale verso spot satellite contenenti la stessa coltura mescolata con un antibiotico, utilizzando una piastra di agar e l'imaging time-lapse.

Protocollo

1. Crescita di P. aeruginosa e condizioni di placcatura

1. Preparare 400 ml di brodo di lisogenesi (LB) aggiungendo 10 g di miscela in polvere LB-Miller a 400 ml di ddH₂O. Aggiungere altri 8 g di agar per piastre di Petri di agar al 2% di LB. Autoclave per sterilizzare.
2. Versare 20 mL di terreno di LB-agar fuso in piastre di Petri di 10 cm di diametro e lasciarle solidificare a temperatura ambiente per una notte. Conservare il terreno liquido a temperatura ambiente e le piastre di agar a 4 °C.
3. Striare P. aeruginosa su una capsula di Petri LB-agar da un brodo congelato conservato a -80 °C utilizzando anse sterili o bastoncini di legno. Incubare la capsula di Petri capovolta per una notte a 37 °C. Conservare la piastra di agar LB a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
4. Prelevare una singola colonia dalla capsula di Petri con un anello sterile o un bastoncino di legno, inocularla in 2 ml di terreno e incubare la coltura fino alla saturazione durante la notte (16-18 ore) a 37 °C in un tamburo a rulli impostato a 100 giri/min.
5. Pipettare 5 μL di coltura notturna dalla fase 1.4 utilizzando una pipetta P20 e individuare al centro della piastra di agar sciamatante avvicinando la punta della pipetta con un angolo (10-45°) di 2,5 cm sopra l'area di spotting, pipettando fino al primo arresto e toccando l'agar solo con la goccia di liquido (Figura 1B).
   1. Evitare di toccare l'agar con la punta della pipetta, in quanto ciò può danneggiare l'agar. Usa un modello per posizionare il punto in modo coerente su diverse piastre di agar a sciame.
6. Per i trattamenti antibiotici, mescolare 30 μL di coltura notturna di P. aeruginosa dalla fase 1.4 con 6 μL di 3 mg/mL di gentamicina, 10 μL di 100 mg/mL di kanamicina o 7,5 μL di 100 mg/mL di fosfomicina. Procedi immediatamente al passaggio successivo.
   1. Pipett 6 μl di P. aeruginosa trattata con antibiotico utilizzando una pipetta P20 e spot in 6 posizioni satellitari equidistanti su un cerchio concentrico di 2,8 cm di raggio attorno al centro della capsula avvicinando la punta della pipetta ad un angolo (da 10 a 45°) di 2,5 cm sopra l'area di spotting, pipettando fino al primo arresto, e toccando l'agar con la sola goccia di liquido (Figura 1D).
   2. Evitare di toccare l'agar con il puntale della pipetta, poiché ciò potrebbe danneggiarlo. Usa un modello di placcatura per coerenza.
7. Sostituire i coperchi trasparenti delle piastre di Petri con coperchi neri (Figura 2A).
8. Posizionare le piastre di agar sciame su uno scanner in un'incubatrice impostata a 37 °C con un bagno d'acqua da 10 L per mantenere il 75% di umidità (Figura 1E, Figura 2B). CAUTELA: Non disturbare le cellule macchiate sulle piastre di agar brulicanti. Tenere le piastre sempre rivolte verso l'alto.

Risultati

Figura 1: Schema del saggio di sciamatura di P. aeruginosa e della risposta collettiva allo stress. (A) Le cellule di P. aeruginosa vengono coltivate durante la notte (16-18 o...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Bacto agar, disidratato	BD Difco	214010	Per piastra LB-agar e piastra agar sciamante
Casamino acidi	BD Difco	223050	Per fluidi sciami
D-glucosio	Fisher Chemical	D16500	Destrosio. Per fluidi sciami
Sale disodico di fosfomicina	Industria chimica di Tokyo	F0889	Concentrazione di riserva: 200 mg / mL. Disciolto in ddH₂O
Gentamicina solfato	Sigma-Aldrich	G1914	Concentrazione di riserva: 3 mg/mL. Disciolto in ddH₂O
Kanamicina solfato	Sigma-Aldrich	60615	Concentrazione di riserva: 100 mg / mL. Disciolto in ddH₂O
LB-Miller	BD Difco	244620	Per brodo LB e piastre LB-agar
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma-Aldrich	230391	Per fluidi sciami
Ceppi
Pseudomonas aeruginosa	Laboratorio Siryaporn	AFS27E.118	Ceppo PA14
Forniture
Carta vetrata all'ossido di alluminio	3M	150 Fine	Per coperchi neri
Tessuto nero	Joann	PRD7089	Tessuto nero
Vernice spray nera	Krylon	5592 Nero opaco	Per coperchi neri
Pallone di Erlenmeyer	Kimax	26500	250 ml
Bottiglie di vetro per la conservazione	Pirex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Fascette da 8 pollici	Gardner Bender	E173770	Per il fissaggio di tessuto nero opaco
Piastre di Petri (100 mm x 15 mm)	Pescatore	FB0875712	Lastre di polistirolo 100 x 15 mm
Bastoncini di legno	Pescatore	23-400-102	Per striature e inoculazione di batteri
Attrezzatura
Autoclave	Mercato Forge Industries	STM-E	Per sterilizzare i reagenti
Pipetta da 25 mL	Stati Uniti Scientifici, Inc.	1072-5410	Per pipettare 20 mL per piastre di agar sciamante
Deumidificatore	Frigidaire	FAD704DWD 70 pinte	Per mantenere l'umidità relativa dell'ambiente a circa il 45%
Incubatrice	VWR	89032-092	Per la crescita di batteri a 37 °C
Bagno d'acqua Isotemp	Pescatore	15-462-21Q	Per fluidi di raffreddamento fino a 55 °C
Cappa a flusso laminare	L'azienda Baker	SG603A	Per asciugare le piastre
pipetta P-20	Gilson	F123601	Spotting su piastre di agar brulicanti
Pipetta Controller	Marchio Tech	Accu-Jet	Per pipettare 20 mL per piastre di agar sciamante