Induzione del differenziamento di Vibrio parahaemolyticus in cellule Swarmer

Abstract

Fonte: Heering, J., et al. Induzione del differenziamento cellulare e imaging di singole cellule di Vibrio parahaemolyticus Swimmer e Swarmer. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra l'induzione della differenziazione delle cellule swarmer in Vibrio parahaemolyticus utilizzando un terreno di agar appositamente preparato. Manipolando i segnali ambientali come l'esaurimento del ferro, l'integrazione di calcio e il contatto con la superficie, i batteri sono stimolati a passare dalla loro forma di nuotatori a cellule a sciame allungato con flagelli laterali. Queste cellule differenziate si diffondono sulla superficie solida, formando caratteristici brillamenti a sciame che indicano un cambiamento morfologico riuscito.

Protocollo

1. Induzione del differenziamento cellulare a sciame

NOTA: I passaggi seguenti descrivono come indurre la differenziazione di V. parahaemolyticus nel suo ciclo di vita cellulare a sciame e come stimolare la proliferazione su superfici solide.

1. Sospendere 4 g di Heart Infusion (HI) Agar in 100 mL ddH₂O per preparare le piastre di sciamatura.

2. Far bollire con cura la soluzione di agar HI nel microonde e agitare il flacone di tanto in tanto fino a quando la polvere non si sarà sciolta. Autoclavare in autoclave a 121 °C per 20 min.

3. Dopo la sterilizzazione in autoclave, raffreddare l'agar HI a 60-65 °C. Aggiungere 2,2'-bipiridile alla concentrazione finale di 50 μM (soluzione madre di 50 mM in etanolo al 100%). Aggiungere CaCl₂ a una concentrazione finale di 4 mM (soluzione madre di 4 M in ddH₂O). Se necessario, aggiungere antibiotici nella soluzione per mantenere i plasmidi.

NOTA: Se si prevede di utilizzare un plasmide inducibile, aggiungere un agente induttore alla sua concentrazione finale.

ATTENZIONE: 2,2'-Bipiridil: Tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione). Utilizzare guanti e occhiali di sicurezza quando si maneggia questa sostanza chimica.

4. Versare 30 - 35 mL della soluzione finale di agar HI in una piastra di Petri rotonda da 150 mm e lasciare solidificare l'agar.

5. Poco prima di individuare la coltura cellulare, asciugare la piastra di agar a 37 °C per almeno 10 minuti (o fino a quando eventuali residui liquidi non sono scomparsi, ma non più) in posizione verticale con un coperchio aperto.
NOTA: I tempi di essiccazione dipendono fortemente dall'incubatrice utilizzata e le piastre molto essiccate non consentiranno la sciamatura di V. parahaemolyticus. (Questo passaggio è molto importante!) I piatti devono essere utilizzati freschi e non devono essere più vecchi di 2 - 3 ore. Le vecchie piastre saranno troppo asciutte per stimolare la sciamatura.

6. Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo Luria-Bertani (LB). Incubare la coltura agitando a 37 °C fino a raggiungere OD₆₀₀ = 0,8, di solito ci vogliono circa 2-3 ore. Dopodiché, le cellule sono pronte per essere individuate su piastre di agar a sciame HI.

7. Individuare 1 μL di coltura cellulare al centro di una piastra di sciamatura di agar HI (Figura 1A).

8. Lasciare asciugare la macchia (Figura 1B).

9. Sigillare la piastra con nastro di plastica trasparente e assicurarsi che sia saldamente fissata, altrimenti potrebbe staccarsi durante l'incubazione notturna (Figura 1C).

NOTA: È molto importante che la tenuta sia perfetta. Evitare la formazione di bolle d'aria e pieghe sul nastro quando viene applicato.

10. Incubare la piastra a 24 °C per una notte. Ciò si tradurrà nella formazione di una colonia di sciami di V. parahaemolyticus con divampate di sciami che si estendono dalla periferia della colonia di sciami (Figura 2).

Risultati

Figura 1: Induzione della differenziazione dello swarmer e preparazione delle cellule per l'imaging al microscopio. Visualizzazione semplificata del flusso di lavoro per la produzione di cellule swarmer di V. parahaemolyt...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Componenti multimediali
LB medio	Roth	X968.3
Difco Agar, granulato	BD	214510	Per la preparazione di agar LB con terreno LB
Difco Infuso Cuore Agar	BD	244400	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Agarosio NEEO, ultra qualità	Roth	2267.3	Per la preparazione di tamponi di agarosio per microscopia
Additivi
2,2'-bipiridile	Sigma Aldrich	D216305-25G	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Cloruro di calcio diidrato	Roth	5239.1	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Hardware
Piastra di Petri 150 mm x 20 mm con camme	Sarstedt	82.1184.500	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	-	Utilizzato per l'essiccazione di piastre di sciamatura HI agar