Monitoraggio dell'infezione batterica e della consegna di proteine effettrici nelle cellule vegetali

Abstract

Fonte: Lee, H. et. al., Sistema proteico fluorescente verde diviso per visualizzare gli effettori rilasciati dai batteri durante l'infezione. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra un metodo per monitorare l'infezione batterica e la somministrazione di proteine effettrici nelle cellule vegetali utilizzando la complementazione della proteina fluorescente verde (sfGFP) con la microscopia confocale. L'approccio consente una visualizzazione precisa della traslocazione dell'effettore nel citosol della cellula ospite.

Protocollo

NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.

1. Preparazione dei materiali vegetali (4 settimane)

1. Preparazione per le piante di Nicotiana benthamiana
   1. Semina 2 semi di N. benthamiana sulla superficie del terreno di ogni vaso, copri il vassoio con una cupola di plastica e lascia che i semi germoglino in una camera di crescita a 25 °C, 60% di umidità con un ciclo fotoperiodico luce/buio di 16/8 ore.
   2. Dopo due settimane, scegli e scarta la piantina più piccola in ogni vaso. Continuare a coltivare le piante nelle stesse condizioni di crescita applicate per la germinazione nel passaggio 1.1.1. Aggiungere 1 litro di acqua per vaschetta ogni due giorni.
      NOTA: Le condizioni di crescita delle piante possono variare da un laboratorio all'altro. Pertanto, segui il protocollo di irrigazione regolare per far crescere la pianta in condizioni sane.
   3. In una settimana, trasferisci le piante in un nuovo vassoio e disponile con uno spazio adeguato per un'ulteriore crescita. Continuate a coltivare le piante nelle condizioni descritte al punto 1.1.1 fino a quando non sono pronte per essere infiltrate a 4 settimane di età.
      NOTA: La crescita delle piante può variare a seconda delle condizioni di crescita dei laboratori. Di solito, scopriamo che le piante di N. benthamiana di 4 settimane portano circa sei foglie.
2. Preparato per piante transgeniche di Arabidopsis thaliana
   1. Fare riferimento alla Tabella dei materiali e ordinare i semi transgenici di Arabidopsis .
   2. Immergere ~50 - 100 semi transgenici di Arabidopsis in 1 ml di acqua distillata e conservarli a 4 °C per 3 giorni al buio per sincronizzare l'inizio della germinazione.
   3. Semina ~2 - 3 semi sulla superficie del terreno di un vassoio per piante a spina e copri il vassoio con una cupola di plastica. Lasciare germogliare i semi a 23 °C, 60% di umidità con un ciclo fotoperiodico luce/buio di 10/14 ore.
      NOTA: I semi devono essere omozigoti. Tuttavia, si consiglia di riconfermare la presenza del transgene nel lotto. In questo caso, sterilizzare i semi lavandoli con etanolo al 70% per 2 min, candeggina al 50% (circa il 2% di ipoclorito) contenente lo 0,05% di Triton X-100 per 5 min. Segue il lavaggio 5 - 6 volte con acqua sterile bidistillata (ddH₂O). Dopo la sterilizzazione, stratificare a 4 °C per 3 giorni e impiattarli su terreni di germinazione contenenti 25 μg/L di igromicina B per selezionare le piante transgeniche.
   4. Dopo una settimana, lasciare solo una pianta per tappo e continuare a coltivare le piante nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per il passaggio 1.2.3.
      NOTA: Piante di quattro settimane sono state utilizzate per l'infezione da Pseudomonas syringae . Innaffia le piante a giorni alterni per mantenerle sane.

2. Preparazione della coltura di Pseudomonas (~1 settimana)

1. Costruzione del plasmide per la trasformazione di Pseudomonas
   1. Fare riferimento alla Tabella dei materiali e ordinare il vettore o i vettori desiderati del vettore del sistema di rilascio dell'effettore basato sul sistema di secrezione di tipo III (T3SS).
   2. Inserire il gene effettore di interesse nel vettore di consegna dell'effettore utilizzando il clonaggio a ricombinazione sito-specifica.
      NOTA: Quando si monitora la localizzazione subcellulare della proteina effettrice a lunghezza intera, inserire il gene a lunghezza intera in pBK-GW-1-2 o pBG-GW-1-2. È anche possibile scegliere pBK-GW-1-4 o pBG-GW-1-4 contenente 2x sfGFP11 (11° β-filamento di sfGFP) per aumentare il segnale di fluorescenza. Nel caso di un effettore parziale privo di peptide segnale, utilizzare pBK-GW-2-2 o pBK-GW-2-4.
2. Trasformare il plasmide che trasporta un effettore fuso con il tag sfGFP11 in P. syringae pv. Il pomodoro (Pst) CUCPB5500 utilizzando l'elettroporazione standard.
   NOTA: Se necessario, possono essere utilizzati altri ceppi di Pseudomonas . Il sistema di tag sfGFP11 è costruito per un'ampia gamma di vettori e l'espressione genica dell'effettore è regolata dal promotore AvrRpm1, che è paragonabile, ad esempio, a Pseudomonas fluorescens (EthAn).
3. Distribuire delicatamente le cellule batteriche trasformate sulla superficie delle piastre di agar King's B contenenti 100 μg/mL di rifampicina e 25 μg/mL di kanamicina o 25 μg/mL di gentamicina. Incubare a 28 °C per 2 giorni.
4. Inoculare una colonia in terreno liquido King's B con antibiotici appropriati per il vettore utilizzato e far crescere le cellule durante la notte a 28 °C con agitazione a 200 giri/min.
5. Prepara un brodo di glicerolo. Aggiungere glicerolo autoclavato a una concentrazione finale del 50% e conservare a -80 °C.

3. Espressione transitoria di^{sfGFP1-10 OPT} mirato agli organelli (1-10° β-filamento di sfGFP) in N. benthamiana (4 giorni)

1. Preparazione della coltura di Agrobacterium
   1. Ordinare il/i vettore/i desiderato/i del/i plasmide/i sfGFP1-10^OPT mirato all'organello (fare riferimento alla Tabella dei materiali).
   2. Trasformare il/i plasmido/i in cellule del ceppo GV3101 dell'Agrobacterium tumefaciens . Far crescere le cellule su terreno di agar Luria-Bertani (LB) integrato con 50 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina a 28 °C per 2 giorni.
   3. Da una singola colonia sul terreno di agar LB, inoculare le cellule in 5 mL di terreno LB liquido integrato con 50 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina. Far crescere le cellule durante la notte a 28 °C con agitazione a 200 giri/min.
   4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 min. Versare il mezzo surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di infiltrazione appena preparato.
   5. Misurare la quantità di Agrobacterium ottenendo il valore di densità ottica (OD) ad un'assorbanza di 600 nm (Abs 600 nm). Regolare l'OD₆₀₀ dei batteri a 0,5 con tampone di infiltrazione.
      NOTA: 1 mL di sospensione è sufficiente per infiltrarsi in due punti.
   6. Lasciare la coltura a temperatura ambiente su un dondolo delicato per 1 - 5 ore prima dell'infiltrazione.
   7. Praticare un foro al centro delle foglie da infiltrare con una punta da 10 μL. Utilizzare una siringa senza ago da 1 ml per infiltrare le sospensioni di Agrobacterium . Iniettare con cautela e lentamente circa 500 μl delle sospensioni preparate al punto 3.1.5 nel lato adassiale della foglia tramite la siringa. Ripetere l'infiltrazione su almeno tre piante diverse per le repliche sperimentali.
      NOTA: Per motivi di salute e sicurezza, è necessario indossare una protezione per gli occhi durante l'infiltrazione.
   8. Rimuovere la sospensione batterica rimanente sulle foglie e segnare il confine della regione infiltrata.
   9. Mantenere le piante infiltrate nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per il passaggio 1.1.1 per 2 giorni.

4. Inoculazione di Pseudomonas (4 giorni)

1. Strisciare il ceppo di Pseudomonas trasformato dallo stock di glicerolo al passaggio 2.5 su terreno di coltura in agar King's B con gli antibiotici appropriati a 28 °C per 2 giorni.
   NOTA: La salute di Pseudomonas è molto critica. Se le colonie non si formano bene, striare nuovamente le cellule o propagare le cellule nel mezzo liquido del Re prima di procedere.
2. Inoculare un anello di cellule di Pseudomonas in un terreno liquido di mannitolo-glutammato (MG) a 28 °C agitando a 200 giri/min per una notte.
3. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 min. Versare il mezzo surnatante, risospendere il pellet in 10 mM di MgCl₂ e regolare l'OD₆₀₀ a 0,02 (1 x 10⁷ cfu/mL) per le foglie di N. benthamiana e a 0,002 (1 x 10⁶ cfu/mL) per le foglie di Arabidopsis.
4. Per la N. benthamiana, infiltrare la sospensione di Pseudomonas nell'area delle foglie in cui l'Agrobacterium che trasporta il costrutto sfGFP1-10^OPT è stato infiltrato 2 giorni prima (come nel passaggio 3.1.7). Per l'Arabidopsis transgenico sfGFP1-10^OPT, infiltrare la sospensione di Pseudomonas in due foglie di 4 settimane coltivate a breve distanza di giorno.
   NOTA: Sono necessari almeno tre impianti per le repliche sperimentali.

5. Osservazione del segnale sfGFP tramite microscopia confocale (1 giorno)

1. Taglia il disco fogliare dalle foglie inoculate con Pseudomonas. In momenti specifici dopo l'infiltrazione di Pseudomonas, acquisire l'immagine di due dischi fogliari di 2 cm² dalla singola pianta utilizzando un sistema confocale a scansione laser con obiettivo a immersione in acqua C-Apochromat 40X/1,2 con apertura numerica (NA) o obiettivo a immersione in olio C-Apochromat 63X/0,8 NA. Per evitare che le cellule morte vengano uccise dalle ferite, osservare le celle lontane dal foro di infiltrazione.
2. Avviare l'osservazione con un'impostazione a bassa potenza del laser ad argon da 488 nm. Aumentare la potenza del laser per rilevare sfGFP.
   NOTA: Di solito utilizziamo il 2 - 15% dell'intensità del laser per rilevare il segnale di fluorescenza. Tuttavia, la potenza del laser e le impostazioni di rilevamento devono essere regolate in base al sistema di microscopia dell'utente. In questo caso, i filtri delle emissioni sono stati impostati su 520 - 550 nm. Le cellule morte spesso emettono autofluorescenza sotto l'eccitazione laser a 488 nm. Pertanto, come controllo negativo, lo stesso effettore senza il tag sfGFP11 dovrebbe essere infiltrato e osservato nelle stesse condizioni di osservazione. Inoltre, un'elevata eccitazione laser può indurre l'autofluorescenza della clorofilla. Pertanto, regolare l'intensità del laser utilizzando le cellule vegetali di controllo in modo da non indurre l'autofluorescenza della clorofilla.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linee transgeniche Arabidopsis			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CITO-SFGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Plasmide sfGFP1-10OPT mirato agli organelli			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CITO-SFGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CITO-SFCFP1-10	Addgene	97405
Vettore compatibile con Gateway con tag sfGFP11 per sistema di rilascio di effettori basato su T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)
Ceppi batterici
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz e Jeff Schell, Il promotore del gene TL-DNA 5 controlla l'espressione tessuto-specifica dei geni chimerici trasportati da un nuovo tipo di vettore binario Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente alla gentamicina (50 ug/ml) e alla rifampicina (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Pomodoro CUCPB5500			Kvitko, BH et al. Delezioni, nel repertorio di Pseudomonas syringae pv. I geni effettori di secrezione di tipo III DC3000 del pomodoro rivelano una sovrapposizione funzionale tra gli effettori. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente alla rifampicina (100 ug/ml)
Componenti multimediali
Mezzi di germinazione delle piante			Aggiungere 2,165 g/L di polvere di Murashige & Skoog, 10 g/L di saccarosio all'acqua. Portare a pH 5,8 e aggiungere 2,2 g/L di phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium con vitamine	Duchefa Biochemie	Codice: M0222	Conservare a 4 °C.
Saccarosio	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
LB media			Aggiungere all'acqua 10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito, 10 g/L di NaCl. Per i terreni solidi, aggiungere 15 g/L di micro agar. Autoclave. Lasciare raffreddare la soluzione a 55 °C e, se necessario, aggiungere antibiotico.
Triptone	BD Bioscienze	211705
Estratto di lievito	BD Bioscienze	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro agar	Duchefa Biochemie	Motore M1002
Media di King's B			10 g/L di proteasi peptone #2, 1,5 g/L di K2HPO4 anidro, 15 g/L di agar in acqua. Autoclave. Raffreddare a 55 °C e aggiungere al terreno 15 ml/L di glicerolo sterile, 5 ml/L di MgSO4 . Aggiungi antibiotici se necessario.
Peptone proteoso	BD Bioscienze	212120
Anidro K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glicerolo	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M7506
Bacto Agar	BD Bioscienze	214010
Mezzi liquidi di mannitolo-glutammato (MG)			Aggiungere all'acqua 10 g/L di mannitolo, 2 g/L di acido L-glutammico, 0,5 g/L di KH2PO4, 0,2 g/L di NaCl e 0,2 g/L di MgSO4 . Regolare a pH 7
Mannitolo	Duchefa Biochemie	Codice: M0803
Acido L-glutammico	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Tampone di infiltrazione			10 mM MES (acido 2-(N-morfolino)-etano solfonico), 10 mM MgCl2, 150 μM acetosiringone. pH 5,6; Preparare un nuovo tampone prima dell'uso.
MES	Duchefa Biochemie	Visualizzazione del materiale M1503	Preparare 100 mM (pH 5,6) di brodo in acqua. Filtro sterilizzare.
MgCl2	Sigma-Aldrich	Codice: M8266	Preparare 100 mM di brodo in acqua. Autoclave.
Acetosiringone	Sigma-Aldrich	D134406	Prepara 150 mM di stock in DMSO.
Attrezzature/materiali per microscopi confocali
Sistema confocale a scansione laser 710	Carl Zeiss
Microscopio invertito Axio observer Z1	Carl Zeiss