Isolamento mirato di colonie batteriche mediante degradazione dell'idrogel con pattern di luce

Abstract

Fonte: Fattahi, N., et al. Interfacce idrogel fotodegradabili per lo screening, la selezione e l'isolamento dei batteri. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra l'estrazione di colonie batteriche da un idrogel fotodegradabile utilizzando la luce UV. Viene selezionata una colonia specifica e viene progettata un'esposizione alla luce modellata per avviare la degradazione localizzata dell'idrogel. Dopo aver regolato l'intensità e la durata della luce, viene applicata la luce UV, rilasciando la colonia. La colonia viene quindi aspirata attraverso un tubo e trasferita in un tubo per l'analisi a valle.

Protocol

1. Ceppi batterici e protocolli di coltura

1. Striature di colonie di batteri su piastre di agar integrate con mezzi di crescita appropriati. In questo rapporto, B. subtilis (ceppo 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) è coltivato su ATGN (0,079 M KH₂PO₄ (fosfato monobasico di potassio), 0,015 M (NH₄)₂SO₄ (solfato di ammonio), 0,6 mM MgSO₄·7H₂O (solfato di magnesio eptaidrato), 0,06 mM CaCl₂·2H₂O (cloruro di calcio diidrato), 0,0071 mM MnSO₄·H₂O (solfato di manganese (II) monoidrato), 0,125 M FeSO₄·7H₂O (solfato ferroso eptaidrato), 28 mM glucosio, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L di agar) piastre di agar integrate con 100 μg/mL di spectinomicina ed E. coli (ceppo 25922, ATCC) su piastre di agar ATGN integrate con 100 μg/mL di ampicillina.
   NOTA: Precedenti segnalazioni di incapsulamento e rilascio di idrogel con questi materiali hanno utilizzato cellule C58 di A. tumefaciens
2. Scegli le colonie desiderate dalle piastre di agar ATGN e avvia le colture durante la notte. Per i ceppi di E. coli e B. subtilis qui utilizzati, coltura a 37 °C agitando a 215 giri/min in terreno liquido ATGN per 24 ore. Conservare le colture cellulari in glicerolo al 50% a -80 °C fino a un futuro utilizzo.
3. Prelevare le colonie di entrambi i ceppi da ceppi di glicerolo utilizzando anse di inoculazione sterili e incubare in terreno liquido ATGN per 24 ore a 37 °C e 215 giri/min.

2. Preparazione del materiale necessario per la formazione dell'idrogel

1. Sintesi fotodegradabile di PEG-o-NB-diacrilato (poli(glicole etilenico)-orto-nitrobenzildiacrilato)
   NOTA: La sintesi interna del diacrilato PEG-o-NB è stata ben descritta e precedentemente riportata. In alternativa, poiché la sintesi è di routine, può essere esternalizzata da un impianto di sintesi chimica.
2. Tampone di reticolazione
   1. Prendi la ricetta per il terreno selezionato per il ceppo batterico e prepara il terreno con 2x nutrienti. Aggiungere fosfato, ad es. NaH₂PO₄ (sodio diidrogeno fosfato), al terreno fino a una concentrazione finale di 100 mM. Quindi, regolare il valore del pH su 8 utilizzando 5 M NaOH (idrossido di sodio) (acquoso).
   2. Sterilizzare la soluzione tampone e conservarla a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: Omettere eventuali metalli di transizione presenti nel mezzo, poiché questi metalli catalizzano l'ossidazione dei tioli a disolfuri.
3. Soluzione di diacrilato PEG-o-NB
   1. Per ogni mg di polvere aliquotata di PEG-o-NB-diacrilato (peso molecolare 3.400 Da), aggiungere 3,08 μL di acqua ultrapura per raggiungere una concentrazione di 49 mM di PEG-o-NB-diacrilato (98 mM di concentrazione di acrilato).
   2. Agitare la soluzione fino a quando non è ben miscelata e conservare questa soluzione a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
4. Soluzione di PEG-tiolo a 4 bracci
   1. Per la preparazione di PEG-tiolo a 4 bracci (peso molecolare 10.000 Da), aggiungere 4 μL di acqua ultrapura per mg di polvere per raggiungere una concentrazione di 20 mM (80 mM di concentrazione di tiolo).
   2. Agitare questa soluzione fino a quando non è ben miscelata e conservarla a -20 °C fino a nuovo utilizzo.

3. Preparazione di vetrini coprioggetti perfluoroalchilati (non reattivi)

1. Posiziona fino a 5 vetrini (25 mm x 75 mm x 1 mm) all'interno di una busta per vetrini in polipropilene. Sonicare i vetrini con una soluzione detergente al 2% (p/v) (Tabella dei materiali) per 20 minuti.
2. Sciacquare i vetrini tre volte con acqua ultrapura, quindi sonicare i vetrini in acqua per 20 minuti. Asciugare i vetrini utilizzando un getto di N₂ (azoto).
3. Pulire al plasma (vedi Tabella dei materiali) su entrambi i lati dei vetrini secondo il protocollo nella sezione 4.1 per 2 minuti.
4. Riposizionare i vetrini puliti al plasma nella busta per vetrini e riempire il contenitore con una soluzione allo 0,5% (v/v) di tricloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluoroottil)silano in toluene. Lasciare funzionalizzare questi vetrini per 3 ore a temperatura ambiente (RT).
5. Dopo che i vetrini sono stati funzionalizzati, sciacquare i vetrini all'interno del mailer per vetrini, prima con toluene e poi con etanolo (tre volte con ciascun solvente). Quindi, asciugare ogni vetrino funzionalizzato con un flusso di N₂.

4. Preparazione di vetrini coprioggetti (base) funzionalizzati con tiolo

1. Pulizia dei vetrini coprioggetti con un pulitore al plasma
   1. Posizionare i vetrini coprioggetti da 18 mm x 18 mm in una capsula di Petri. Quindi, posizionare la capsula di Petri in una camera del pulitore al plasma e accendere l'alimentazione del pulitore al plasma.
   2. Accendere la pompa del vuoto per eliminare l'aria all'interno della camera fino a quando il manometro non segna 400 mTorr.
   3. Aprire la valvola dosatrice per far entrare l'aria nella camera fino a quando il manometro non raggiunge una pressione costante (800-1000 mTorr). Quindi, selezionare RF con la modalità "Hi" ed esporre i vetrini coprioggetti per 3 minuti.
   4. Dopo 3 minuti, disattivare la modalità RF e la pompa del vuoto.
   5. Togliete la capsula di Petri dalla camera, capovolgete i vetrini, rimetteteli nella camera al plasma ed esponete l'altro lato del vetrino coprioggetti.
   6. Ripetere i passaggi 4.1.2-4.1.4 per pulire il lato non trattato del vetrino coprioggetti con il plasma.
   7. Dopo aver completato il processo, rimuovere la capsula di Petri dalla camera e spegnere il pulitore al plasma e la pompa del vuoto.
2. Pulizia e idrossilazione dei vetrini coprioggetti con soluzione piranha
   NOTA: I protocolli standard di pulizia dei piranha possono essere utilizzati per pulire e idrossilare i vetrini. La soluzione di piranha è una miscela 30:70 (v/v) di H₂O₂ (perossido di idrogeno) e H₂SO₄ (acido solforico). Possono essere utilizzati anche metodi alternativi per la pulizia dei vetrini coprioggetti.
   ATTENZIONE: La soluzione di Piranha è fortemente corrosiva ed esplosiva con solventi organici e deve essere maneggiata con estrema cautela. Devono essere implementate adeguate misure di sicurezza e contenimento, come l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, grembiule resistente agli agenti chimici, occhiali di sicurezza, visiera, guanti butilici resistenti agli acidi). Tutti i bicchieri e le superfici di lavoro a contatto con la soluzione piranha devono essere puliti, asciutti e privi di residui organici prima dell'uso. La soluzione di piranha non deve mai essere conservata in un contenitore parzialmente chiuso o chiuso.
   1. Posizionare una pirofila di vetro pulita da 100 mm x 50 mm su un agitatore magnetico con velocità di agitazione regolabile sotto una cappa aspirante e aggiungere 14 ml di H₂SO₄ alla piastra.
   2. Posizionare delicatamente una piccola ancoretta magnetica rivestita in teflon utilizzando una pinza rivestita in teflon all'interno del piatto. Quindi, ruotare lentamente l'agitatore per evitare schizzi di acido.
   3. Quindi, aggiungere delicatamente 6 ml di H₂O₂ al piatto e lasciare che la soluzione diventi ben amalgamata.
   4. Spegnere l'agitatore, quindi rimuovere l'ancoretta di cottura dal piatto utilizzando la pinza. Quindi, posizionare delicatamente i vetrini coprioggetti all'interno del piatto utilizzando la pinza e impostare la temperatura a 60-80 °C.
   5. Dopo 30 minuti, rimuovere delicatamente i vetrini coprioggetti usando la pinza e immergerli in acqua deionizzata (DI) due volte per lavare via la soluzione di piranha residua.
   6. Dopo il risciacquo con acqua, conservare i vetrini coprioggetti in acqua deionizzata presso RT fino a nuovo utilizzo.
   7. Spegnere la piastra e lasciare raffreddare la soluzione di piranha.
   8. Per smaltire la soluzione di piranha, posizionare delicatamente il piatto di vetro da 100 mm x 50 mm contenente la soluzione di piranha raffreddata in un bicchiere di vetro vuoto più grande di almeno 1,5 L di volume. Quindi aggiungere 1 litro di acqua per diluire e aggiungere il bicarbonato di sodio in polvere per neutralizzare. Si noti che il bicarbonato di sodio provoca bolle e generazione di calore e deve essere aggiunto molto lentamente; In caso contrario, le bolle possono causare schizzi di acido. Quando l'ulteriore aggiunta di bicarbonato di sodio non provoca bolle, controllare il pH con carta pH per verificare che sia stato neutralizzato. Una volta che la soluzione è stata neutralizzata e raffreddata, può essere versata nel lavandino.
3. Funzionalizzazione tiolica dei vetrini coprioggetti
   1. Preparare una soluzione al 5% (v/v) di 269 mM di soluzione di (3-mercaptopropil) trimetossisilano (MPTS) in toluene secco.
   2. Aggiungere 10 mL della soluzione alle singole provette da centrifuga coniche da 50 mL. Posizionare un vetrino coprioggetti pulito in ogni provetta e immergerlo nella soluzione.
      NOTA: Un vetrino coprioggetti per provetta da 50 mL viene utilizzato per assicurare la tiolazione di entrambi i lati del substrato senza essere disturbato da altri substrati.
   3. Dopo 4 ore, lavare ogni vetrino coprioggetti (quattro lavaggi per vetrino coprioggetti) con toluene, una miscela 1:1 (v/v) di etanolo: toluene ed etanolo.
      NOTA: Questo viene fatto immergendo ogni vetrino coprioggetti in sequenza in provette da centrifuga coniche contenenti le soluzioni menzionate.
   4. Dopo aver risciacquato il substrato, immergerlo in etanolo e conservarlo a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: A seconda del numero di vetrini, questo metodo può diventare laborioso a causa del trattamento dei vetrini coprioggetti uno alla volta. Per più vetrini, è possibile utilizzare i barattoli Columbia che si adattano a più vetrini contemporaneamente.

5. Fabbricazione di array di micropozzetti in silicio

1. Rivestimento in parylene: utilizzare il protocollo standard descritto in precedenti articoli di ricerca per rivestire i wafer di silicio con parylene.
2. Microfabbricazione: Seguire il protocollo descritto da Barua et al. per progettare e fabbricare l'array di micropozzetti. ​

6. Formazione di idrogel

1. Formazione di idrogel sfuso su vetrini coprioggetti
   1. Soluzione precursore dell'idrogel: aggiungere 12,5 μl del tampone reticolante a una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL, seguiti da 5,6 μl di soluzione di PEG-o-NB-diacrilato. Infine, aggiungere alla miscela 6,9 μl di soluzione di PEG-tiolo a 4 bracci.
      NOTA: L'aggiunta del tiolo PEG a 4 bracci alla miscela avvia la reazione di reticolazione. Pertanto, la soluzione precursore dell'idrogel deve essere utilizzata immediatamente dopo la miscelazione.
   2. Per l'incapsulamento cellulare nella soluzione precursore dell'idrogel, seguire i passaggi 6.1.3-6.1.9.
   3. Per l'incapsulamento cellulare, prima del passaggio 6.1.1, inoculare il tampone di reticolazione con la densità cellulare desiderata. Come riportato in precedenza19, è stato osservato che la densità cellulare di 7,26 × 10⁷ CFU/mL nel tampone di reticolazione è correlata a una densità di ~ 90 cellule/mm² incapsulate attraverso l'idrogel.
   4. Posizionare il vetrino coprioggetti a base tiolata su una capsula di Petri pulita. Posizionare due distanziatori (vedi Tabella dei materiali) sui due lati opposti del vetrino coprioggetti.
      NOTA: La funzionalizzazione tiolica dei vetrini coprioggetti è necessaria per l'attacco covalente dell'idrogel alla superficie del vetrino. Ciò avviene attraverso la reazione dei gruppi tiolici sulla superficie e dei gruppi acrilati presenti nella soluzione precursore dell'idrogel.
   5. Fissare i distanziatori sul vetrino coprioggetto di base fissandoli con nastro adesivo alla capsula di Petri.
   6. Pipettare il volume desiderato della soluzione precursore su un vetrino perfluoroalchilato non reattivo.
   7. Posizionare il vetrino in vetro perfluoroalchilato sul vetrino coprioggetti di base (Figura 1C). Attendere 25 minuti a RT per il completamento della formazione dell'idrogel.
   8. Dopo la gelificazione, rimuovere delicatamente il vetrino in vetro perfluoroalchilato. L'idrogel rimarrà attaccato al vetrino coprioggetti di base. ​
      NOTA: Per vetrini coprioggetti da 18 mm x 8 mm per ottenere una membrana spessa 12,7 μm, utilizzare ~7 μl della soluzione precursore (Figura 1A, B). L'uso di volumi più elevati di soluzione precursore può provocare la formazione di un idrogel sotto il vetrino coprioggetti di base. Ciò potrebbe causare l'adesione del vetrino coprioggetti di base alla piastra di Petri e la rottura in caso di tentativo di rimozione. Inoltre, i residui di idrogel sotto il vetrino coprioggetti sono problematici per la microscopia. È necessaria una rimozione delicata del vetrino in vetro perfluoroalchilato non reattivo, poiché una rimozione rapida può danneggiare l'idrogel.
   9. Posizionare il substrato in una piastra di Petri da 60 mm x 15 mm nel terreno di coltura specificato. In questo caso, per 24 ore, sono stati utilizzati terreni ATGN integrati con 100 μg/mL di spectinomicina per B. subtilis o 100 μg/mL di ampicillina per E. coli a 37 °C.

7. Preparazione del materiale per l'estrazione cellulare

1. Preparazione del supporto PDMS (polidimetilsilossano)
   1. Fissa insieme una pila di dieci vetrini coprioggetti da 18 x 18 mm e incolla questa pila di vetrini coprioggetti sul fondo di una capsula di Petri.
   2. Per fabbricare i supporti PDMS, mescolare il precursore PDMS e l'agente indurente a un rapporto in volume di 10:1 in un bicchiere di plastica, degassare la miscela in un essiccatore sottovuoto e quindi versare la miscela nella capsula di Petri.
   3. Polimerizzare il PDMS per 90 minuti a 80 °C. Quindi, tagliare intorno al blocco nastrato per rimuovere il supporto PDMS e posizionare il supporto PDMS su un vetrino per facilitarne la manipolazione per la microscopia.
2. Preparazione di microsiringhe e tubi
   1. Tagliare 20 cm di tubo in PTFE (politetrafluoroetilene) (0,05 in ID) e collegare un'estremità del tubo a una siringa da 100 μl di microlitri.
      NOTA: Per l'estrazione, evitare l'uso di pipette poiché l'estrazione delle cellule rilasciate tramite una punta della pipetta può danneggiare la superficie dell'idrogel e portare a contaminazione.

8. Degradazione dell'idrogel con lo strumento di illuminazione modellata

1. Accendere il microscopio (vedere Tabella dei materiali). Quindi, attivare lo strumento di illuminazione con motivo (vedere Tabella dei materiali).
2. Accendere il modulo di controllo analogico e digitale della sorgente luminosa a LED da 365 nm. Quindi, accendere il modulo di controllo della sorgente luminosa a LED.
3. Aprire il software del microscopio e il software dello strumento di illuminazione con motivi. Quando si apre la finestra di configurazione hardware, selezionare il pulsante Carica.
   NOTA: Qui verranno caricati tre dispositivi. (Fotocamera di terze parti, un modulo di controllo e lo strumento di illuminazione con motivi)
4. Premere il pulsante Start. Si aprirà ora la finestra del software di light patterning. Seleziona la prima opzione, il pulsante Controllo dispositivo, nella barra laterale sinistra della finestra.
5. Calibrare lo strumento di illuminazione con motivo.
   NOTA: La calibrazione deve essere eseguita con lo stesso obiettivo del microscopio e lo stesso filtro che verranno utilizzati per l'esposizione alla luce.
   1. Impostare l'obiettivo del microscopio su un ingrandimento di 10x.
      NOTA: Questo ingrandimento consente una distanza di lavoro sufficiente tra la lente del microscopio e la superficie del campione. Consente inoltre di monitorare e registrare il processo di recupero in tempo reale attraverso la finestra dell'immagine.
   2. Impostare la lente e il filtro del microscopio sulle impostazioni utilizzate per l'esposizione alla luce e posizionare lo specchio di calibrazione sotto il microscopio.
   3. Nella finestra Controllo dispositivo, premere la scheda Controllo LED. Accendi il LED #1 e imposta l'intensità della luce sul numero desiderato. Negli esperimenti di estrazione standard, questo valore è impostato al 60%.
   4. Premere la scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione con motivo nella finestra Controllo dispositivi. Quindi, premere il pulsante Mostra griglia.
      NOTA: Sullo specchio di calibrazione verrà proiettato un motivo a griglia.
   5. Regolare la messa a fuoco del microscopio e l'esposizione della fotocamera per ottenere un'elevata qualità dell'immagine della griglia e ruotare la fotocamera per allineare le linee della griglia parallelamente al telaio della finestra della fotocamera, se necessario.
   6. Selezionare il pulsante Calibrazione guidata nella scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione con motivo e seguire le istruzioni fornite dal software in questa finestra. NOTA: Verrà aperta una finestra di configurazione della fotocamera di terze parti.
   7. Si aprirà una finestra di selezione del tipo di calibrazione. Selezionare Calibrazione automatica e premere Avanti.
   8. Quando si apre la finestra di regolazione della pre-calibrazione, seguire le istruzioni del software e premere il pulsante Avanti.
   9. Quando si apre la finestra Informazioni mappatura, salvare questa calibrazione di conseguenza nella cartella desiderata. Questo viene fatto inserendo la data, il nome del microscopio, la lente dell'obiettivo e il filtro.
   10. Dopo la calibrazione, premere il pulsante Definizione area di lavoro che si trova sotto la scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione con motivo per definire l'area di lavoro dello strumento di illuminazione con motivo, se necessario.
6. Sezione Sequence Design per la preparazione del modello.
   1. Premere il pulsante Sequence Design nella barra laterale sinistra della finestra del software. Quindi, premere il pulsante Editor sequenza profilo.
   2. Quando si apre la finestra Editor sequenza profilo, selezionare l'opzione Nuovo profilo nell'elenco profili.
      NOTA: Ora si aprirà una finestra dell'Editor dei modelli.
   3. Preparare il modello desiderato per l'esposizione alla luce scegliendo diverse forme e dimensioni del modello o disegnando manualmente il motivo, se lo si desidera.
   4. Per i modelli a cerchio e a croce spezzata per l'idrogel sfuso, seguire i passaggi 8.6.5- 8.6.6
   5. Per i modelli circolari, definire un cerchio con un diametro di 30 μm su una colonia batterica bersaglio per coprire l'intera colonia. Scegli il colore di riempimento della forma: bianco.
   6. Per i motivi a croce spezzati, scegliere la forma del rettangolo dalla finestra di disegno del modello con dimensioni di 3 μm x 8 μm. Posiziona quattro rettangoli con queste dimensioni sui bordi della colonia bersaglio, mentre metà dei motivi ha una sovrapposizione con la colonia.
   7. Per i modelli circolari e ad anello per gli array di micropozzetti, seguire i passaggi 8.6.8-8.6.10.
   8. Per i modelli circolari, disegnare un cerchio di 10 μm di diametro attorno al perimetro del pozzetto. Scegli il colore di riempimento della forma: bianco.
   9. Per il motivo dell'anello, disegna un cerchio di diametro 20 μm, posizionalo sopra il pozzetto e scegli il colore di riempimento della forma bianco.
   10. Disegna un altro motivo circolare di diametro 10 μm con il colore nero della forma di riempimento e posizionalo attorno al perimetro del pozzo.
7. Modifica il modello e modifica le forme in base al metodo di estrazione desiderato. Assicurarsi che il motivo desiderato esista all'interno dell'area di lavoro dello strumento di illuminazione con motivo.
8. Posizionare il campione in un supporto PDMS e pipettare il terreno definito sopra il campione per prevenire la disidratazione del campione e fornire una soluzione di supporto per le cellule rilasciate.
9. Quindi, sostituirlo con lo specchio di calibrazione.
10. Regola la messa a fuoco del microscopio per ottenere un'immagine nitida delle colonie all'interno dell'idrogel. Ispeziona le colonie per identificare una colonia di interesse.
11. Qui, progetta i modelli di luce mentre la vista della telecamera mostra le colonie all'interno del campione per testare diversi modelli per l'estrazione cellulare.
12. Salvate il modello definito. Dopo aver salvato il modello definito, selezionare la sezione Controllo sessione.
13. In questa sezione, nella scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione con motivo, aggiungi la sequenza salvata.
14. Dopo aver aggiunto la sequenza, scegli l'opzione per simulare il motivo da visualizzare e regolare per la posizione di esposizione desiderata.
    NOTA: La posizione del campione può essere regolata qui per garantire che il modello venga proiettato con precisione nell'area desiderata.
15. Quindi, regola l'intensità della luce al 60% e il tempo di esposizione a 40 s nella scheda di controllo del LED e avvia il processo di esposizione.
16. Monitora la degradazione dell'idrogel in tempo reale e in modalità campo chiaro per garantire il rilascio delle cellule.
    NOTA: Evitare qualsiasi movimento verso il campione durante l'esposizione alla luce in quanto può causare il degrado delle aree indesiderate dell'idrogel con conseguente contaminazione incrociata.

9. Recupero delle cellule

1. Dopo l'esposizione alla luce a 365 nm e il rilascio delle cellule, le cellule vengono raccolte utilizzando una siringa da microlitri e un tubo microfluidico (Figura 2).
   NOTA: Il recupero delle cellule deve essere effettuato immediatamente dopo l'esposizione del modello. Ciò consente il recupero localizzato delle cellule prima che le cellule rilasciate si allontanino dall'area irradiata.
2. Cambiare il microscopio da campo chiaro a filtro FITC o TRITC per consentire la visualizzazione dell'area esposta del campione ad occhio nudo.
3. Una volta individuata l'area esposta, posizionare l'estremità del tubo sul punto irradiato. Quindi, riportare il filtro del microscopio in campo chiaro per monitorare il recupero delle cellule in tempo reale.
4. Utilizzare la siringa attaccata all'altra estremità del tubo per estrarre con cautela le cellule rilasciate. Prelevare 200 μl della soluzione e inserire la soluzione in una provetta da centrifuga da 1,5 mL per l'analisi del DNA o la piastratura.

Results

Figura 1: Formazione di idrogel su vetrini in vetro tiolato. (A) I distanziatori con uno spessore di 12,7 μm sono posizionati su due lati opposti di un vetrino coprioggetti di base contenente gruppi tiolici reattivi. (B) La soluzione precurs...

Materials