Quantificazione dell'alginato batterico mediante il dosaggio del carbazolo dell'acido uronico

Abstract

Fonte: Al Ahmar, R., et al. Coltura di una piccola colonia, variante di Pseudomonas aeruginosa e quantificazione del suo alginato. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra un test colorimetrico per quantificare l'alginato prodotto da Pseudomonas aeruginosa, utilizzando il carbazolo per rilevare gli acidi uronici dopo l'idrolisi acida. Il metodo consente l'analisi comparativa della produzione di alginato normalizzato alla biomassa batterica nella ricerca e negli studi clinici.

Protocollo

1. Saggio del carbazolo dell'acido uronico

1. Identificare una singola colonia da una coltura pura del ceppo desiderato da testare. Usando uno stuzzicadenti sterile, prelevare la colonia e metterla in una provetta di coltura contenente 5 ml di brodo di isolamento (PIB) di Pseudomonas . Coltivare in un'incubatrice shaker a 37 °C per 24 ore.
   NOTA: I ceppi successivi, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB e PAO581pyrD, sono stati coltivati su piastre PIA (Pseudomonas isolation agar) o piastre PIA integrate con 0,1 mM di uracile per raccogliere l'alginato per la misurazione.
2. Su una piastra PIA preriscaldata, aggiungere 150 μl di brodo PIB fermentato (per piastre da 15 mm x 100 mm) o 450 μl di brodo (per piastre da 15 mm x 150 mm). Utilizzando un divaricatore di cellule sterile, distribuire il brodo sul piatto. Far crescere la piastra a 37 °C per 24 ore.
   NOTA: Aspirare l'eventuale liquido in eccesso dalla piastra utilizzando una pipetta inclinando la piastra da un lato. Entrambe le piastre PIB e PIA utilizzate nel protocollo contengono 20 mL/L di glicerolo, che le cellule utilizzano come fonte di carbonio per favorire la produzione di alginato.
3. Utilizzando un pipettatore e una pipetta sterile da 50 mL, aggiungere lo 0,85% di NaCl (cloruro di sodio) al prato coltivato e raccogliere il campione raschiando la piastra con uno spandiconcime. Aspirare il campione utilizzando una pipetta fresca da 50 mL in una provetta di raccolta da 50 mL. Agitare il campione in alto per mescolare e posizionare i campioni sul ghiaccio.
   NOTA: Il volume dell'aggiunta di NaCl allo 0,85% varia a seconda delle dimensioni della piastra. Per le piastre da 15 mm x 100 mm, utilizzare 10-30 mL e per le piastre da 15 mm x 150 mm, utilizzare 20-50 mL.
4. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) dei campioni aggiungendo 1 mL di campione a una cuvetta monouso e leggendo il OD utilizzando uno spettrofotometro. Ripetere questo passaggio 2 volte per ottenere una triplicazione di letture per ogni campione.
5. Aggiungere 3 mL della soluzione di acido solforico/borato alle provette di coltura e lasciarla riposare sul ghiaccio. Aggiungere lentamente 350 μl del campione raccolto alla miscela acida nelle provette e agitare brevemente a bassa temperatura.
   1. Preparare il brodo di borato aggiungendo 10,099 g di polvere di idrossido di potassio (KOH) a 45 ml di acqua. Aggiungere 24,74 g di acido borico (H₃BO₃) alla miscela e portare il volume a 100 ml.
   2. Metti una bottiglia da 1 litro in un lavandino con ghiaccio e riempila con 500 ml di acido solforico concentrato. Aggiungere LENTAMENTE 15 mL del brodo di borato preparato. Lasciare raffreddare la bottiglia.
   3. Aggiungere altri 10 mL di brodo di borato per un totale di 25 mL. Una volta raffreddata la bottiglia, portare il volume a 1 L.
      CAUTELA: Questo metodo si basa sull'uso di acido solforico altamente concentrato. Per garantire la sicurezza è necessario utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati e seguire il corretto protocollo di smaltimento del campione.
      NOTA: Per un controllo positivo, una concentrazione nota di acido D-mannuronico e/o un campione di alginato batterico noto viene raccolto e purificato attraverso ceppi di P. aeruginosa produttori di alginato (ad esempio, PAO581-PAO1mucA25). Per un controllo negativo, utilizzare una soluzione di NaCl allo 0,85% e/oPAO1Δ algD (delezione in-frame del gene algD che rende i batteri completamente incapaci di produrre alginato). È possibile realizzare più tubi da ciascun campione per aumentare il numero di ripetizioni tecniche per facilitare l'analisi statistica. Preparare 3-5 provette di ciascun campione.
6. Aggiungere 100 μl di carbazolo allo 0,1% in soluzione di etanolo alla miscela acido/campione. Tappare il tubo e vorticare a temperatura media per 5 s. Mettere in bagnomaria a 55 °C per 30 min.
7. Dopo l'incubazione, rimuovere le provette e agitare brevemente alla massima potenza e lasciare raffreddare per 5 minuti.
   NOTA: Il colore da vedere sarebbe una sfumatura di viola. Il colore rimarrà stabile per la misurazione per 1−2 ore.
8. Leggere l'OD₅₃₀ di ciascuna provetta aggiungendo 1 mL della miscela a una cuvetta pulita e leggendo l'OD dei campioni a 530 nm su uno spettrofotometro. Utilizzare il tubo con NaCl allo 0,85% come bianco nello spettrofotometro.
9. Preparare una curva standard misurando l'OD₅₃₀ delle diluizioni seriali di concentrazioni note di acido D-mannuronico (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL e 8 μg/mL). Ripeti 2 volte. Estrai un'equazione lineare da queste letture.
   NOTA: La curva standard deve essere eseguita una sola volta. L'equazione lineare estratta da essa può essere utilizzata per test successivi.
   1. Calcolare la concentrazione di alginato in ciascun campione utilizzando la curva standard e dividere la concentrazione di alginato dall'equazione lineare per OD₆₀₀ per ottenere la quantità totale di alginato per OD₆₀₀.

Materiali