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1. ELISA per la quantificazione dell'alginato
1. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 50 μl del campione raccolto a una piastra a 96 pozzetti non trattata. Aggiungere 50 μl di tampone di rivestimento (tampone carbonato/bicarbonato pH 9,6) ai pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C per 2 ore.
NOTA: Per un controllo positivo, è possibile utilizzare una concentrazione nota di acido D-mannuronico e/o un ceppo stabile noto che produce alginato (ad es. PAO581- PAO1mucA25). Per un controllo negativo, utilizzare una soluzione di NaCl allo 0,85% e/oPAO1Δ algD (la delezione nel frame del gene algD rende i batteri completamente incapaci di produrre alginato). È possibile creare più pozzetti da ciascun campione per aumentare il numero di ripetizioni tecniche per facilitare l'analisi statistica. Preparare 3-5 pozzetti di ciascun campione.
2. Utilizzando un flacone a spruzzo, lavare i pozzetti della piastra 2 volte con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con lo 0,05% di Tween 20 (PBS-T) riempiendo i pozzetti, quindi svuotandoli capovolgendo la piastra.
3. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 200 μl di tampone bloccante (10% di latte scremato in PBS-T) ai pozzetti. Incubare a 4 °C per una notte.
NOTA: Avvolgere il piatto in una pellicola di paraffina o in una pellicola termoretraibile per evitare l'evaporazione in frigorifero.
4. Utilizzando un flacone a spruzzo, lavare i pozzetti della piastra 2 volte con PBS-T riempiendo i pozzetti e quindi svuotandoli capovolgendo la piastra.
5. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 100 μl di anticorpo primario diluito (anticorpo monoclonale anti-alginato di topo) ai pozzetti e incubare a 37 °C per 1-2 ore.
NOTA: L'anticorpo primario (anticorpo monoclonale anti-alginato di topo) è stato fornito a una concentrazione di 0,5 μg/mL (diluizione di 1:2.000 di 1 mg/mL) in soluzione di diluente anticorpale (latte scremato all'1% in 1x PBS).
6. Usando un flacone a spruzzo, lavare i pozzetti della piastra 3 volte con PBS-T riempiendo i pozzetti, quindi svuotandoli capovolgendo la piastra.
7. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 100 μl di anticorpo secondario diluito ai pozzetti e incubare a 37 °C per 1−2 ore.
NOTA: L'anticorpo secondario utilizzato era l'anticorpo anti-poli-perossidasi di rafano (HRP) di capra perforante alla concentrazione di 0,25 μg/mL (diluizione di 1:2.000 di 0,5 mg/mL) in soluzione di diluente anticorpale.
8. Utilizzando un flacone a spruzzo, lavare i pozzetti della piastra 3 volte con PBS-T riempiendo i pozzetti e quindi drenandoli capovolgendo la piastra.
9. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 100 μL di soluzione TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina)-ELISA (Saggio di immunoassorbimento enzimatico) (Tabella dei materiali) e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
NOTA: Il colore di una reazione positiva sarebbe una sfumatura di blu.
10. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 100 μl di soluzione di arresto (acido solforico 2 N).
NOTA: Il colore passerà dal blu al giallo quando viene aggiunta la soluzione di arresto. Il colore è stabile fino a 30 minuti dopo l'interruzione della reazione.
11. Utilizzando un lettore di piastre, leggere il diametro esterno a 450 nm.
12. Produrre una curva standard misurando l'OD450 delle diluizioni seriali di concentrazioni note di acido D-mannuronico (1.024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL e 8 μg/mL). Ripeti 2 volte. Da queste letture, estrarre un'equazione lineare.
NOTA: La curva standard deve essere eseguita una sola volta. L'equazione lineare estratta da essa può essere utilizzata per test successivi.
1. Calcolare la concentrazione di alginato in ciascun campione utilizzando la curva standard e dividere la concentrazione di alginato dall'equazione lineare per OD600 per ottenere la quantità totale di alginato per OD600.