Modellazione della colonizzazione vaginale murina da parte di batteri anaerobi

Abstract

Fonte: Morrill, S. R., et al. Modelli di colonizzazione vaginale murina da parte di batteri cresciuti anaerobicamente. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra un protocollo per modellare la colonizzazione vaginale nei topi utilizzando batteri anaerobi resistenti agli antibiotici. Si inizia con il trattamento ormonale per aumentare la suscettibilità epiteliale, seguito dall'inoculazione vaginale e dalla co-inoculazione in condizioni anaerobiche. La procedura si conclude con il campionamento post-inoculazione e la coltura per valutare la colonizzazione batterica e la formazione di biofilm.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione dell'inoculo

NOTA: Questa sezione contiene le fasi generali per la preparazione degli inoculi da Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR. Tutti i passaggi in questa sezione devono essere eseguiti in una camera anaerobica.

1. Mettere in ciclo tutti i reagenti, inclusi il brodo New York City III (NYCIII), l'agar e la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), in una camera anaerobica per equilibrare per almeno 24 ore prima dell'uso.
   NOTA: In questo caso, è stata utilizzata una camera anaerobica vinilica bilanciata con una miscela di idrogeno gassoso al 5%. La concentrazione interna di ossigeno si attesta in genere a 0 ppm, anche se possono verificarsi aumenti transitori di basso livello (10-25 ppm) quando si fa scorrere i materiali nella camera.
2. Due giorni prima dell'inoculazione vaginale, strisciare la Gardnerella da un brodo di glicerolo congelato su una piastra di agar NYC III nella camera anaerobica. Utilizzare un piccolo contenitore (come una scatola vuota dei puntali per pipette) riempito di ghiaccio secco per mantenere il brodo di glicerolo congelato durante il trasporto dentro e fuori dalla camera.
3. 1 giorno prima dell'inoculazione vaginale, utilizzare 5-10 colonie individuali di Gardnerella dalla piastra per inoculare 10 ml di brodo NYC III. Lasciare crescere la coltura liquida per una notte per 16 ore a 37 °C. Includere una seconda aliquota da 1 mL del terreno di coltura rimasto non inoculato e incubarla insieme alla coltura inoculata per confermare che il terreno non sia contaminato.
4. Preparare l'inoculo da coltura liquida come descritto di seguito. Eseguire il più possibile la preparazione dell'inoculo nella camera anaerobica.
   1. Determinare la densità ottica (OD) della coltura aggiungendo 200 μl di coltura a 800 μl di terreno fresco in una cuvetta da 1,5 mL (diluizione 1:5). Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità (OD) della coltura diluita a una lunghezza d'onda di 600 nm (utilizzare una cuvetta separata con solo terreno fresco come bianco). Moltiplicare la lettura OD per 5 per ottenere l'OD₆₀₀ effettivo della coltura di 16 ore.
   2. Calcola il volume di inoculo necessario per l'esperimento. Ad esempio, per infettare 15 topi con un inoculo di 20 μl per topo, sono necessari 15 x 20 μl = 300 μl di inoculo. Preparare circa il 25% in più di inoculo del necessario, quindi per 15 topi, preparare 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL di inoculo.
   3. Utilizzando l'OD₆₀₀ determinato al punto 1.4.1, calcolare il volume della coltura di 16 ore che deve essere centrifugato e risospeso per ottenere un inoculo OD₆₀₀ = 5,0 nel volume calcolato al punto 1.4.2. Ad esempio, se l'OD₆₀₀ della coltura è 1,5 e il volume dell'inoculo necessario è 375 μL, il volume della coltura da centrifugare è (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
   4. Pipettare il volume di coltura calcolato al punto 1.4.3. in una provetta sterile per microcentrifuga. Pellettare i batteri centrifugando a 16.000 x g per 1-3 minuti.
   5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in PBS anaerobico al volume calcolato al punto 1.4.2. L'inoculo sarà ora a un OD₆₀₀ calcolato di 5,0. Se applicabile, preparare anche una provetta di PBS che funga da veicolo di controllo per i topi nel gruppo di controllo non infetto.
5. Prima di rimuovere la provetta dell'inoculo dalla camera anaerobica, preparare una serie di diluizioni seriali da 1:10 a 1:10 x 10⁶ in PBS. La piastra spot 5 repliche di ciascuna diluizione su una piastra di agar utilizzando una pipetta multicanale per determinare le unità formanti colonie o CFU dell'inoculo. Questa è la CFU di pre-inoculazione.
6. Prelavaggio vaginale e inoculazione con Gardnerella
   1. Preparare i tubi di lavaggio/lavaggio vaginale nella camera anaerobica. Pipettare 70 μl di PBS anaerobico sterile in provette per microcentrifuga da 1,5 mL etichettate con i numeri dei topi. Prepara un tubo di lavaggio per topo. Chiudere ermeticamente i tubi ed estrarli dalla camera anaerobica.
   2. Eseguire una lavanda vaginale su ciascun topo con 50 μl di PBS anaerobico dalle singole provette preparate al punto 2.1. Questi lavaggi vaginali sono i lavaggi pre-inoculazione e possono essere utilizzati per misurazioni e saggi a valle.
      1. Dopo la somministrazione della seconda iniezione di β-estradiolo valerato, posizionare ciascun topo sopra una gabbia o una superficie pulita e dura che possa afferrare con le zampe anteriori. Afferrare delicatamente la parte centrale della coda e sollevarla in modo che i quarti posteriori siano leggermente sollevati e l'apertura vaginale sia esposta.
      2. Utilizzando una pipetta e il puntale del filtro p-200, aspirare 50 μl di PBS dal tubo di lavaggio corrispondente al mouse appropriato. Inserire delicatamente il puntale della pipetta nel lume vaginale ~2-3 mm e pipettare delicatamente il volume di 50 μl dentro e fuori, 3x-4x.
      3. Trasferire il materiale di lavaggio raccolto (~50 μL) nella stessa provetta da cui proviene, pipettandolo su e giù nella provetta di lavaggio che contiene ancora i restanti 20 μL di PBS. Se c'è troppo muco e la punta si ostruisce, utilizzare una punta p200 pulita per raccogliere il materiale rimanente e posizionarlo nello stesso tubo di lavaggio.
   3. Somministrare per via vaginale 20 μL della sospensione batterica concentrata o del controllo del veicolo nella vagina di ciascun topo. Inoculare ogni topo immediatamente dopo il lavaggio vaginale per quel topo (cioè, eseguire il lavaggio e l'inoculazione in sequenza per ogni topo prima di passare al successivo). Per semplificare questo processo, utilizzare due pipette p200, una impostata a 50 μl per i lavaggi e l'altra a 20 μl per le inoculazioni.
      1. Trattenere il mouse come descritto nel passaggio 2.2.1. Utilizzando un puntale p-200, pipettare 20 μL di sospensione batterica nella vagina. Per gli esperimenti di co-inoculazione con due specie/ceppi batterici diversi, utilizzare 10 μl di ciascuna sospensione batterica ed evitare di mescolare i due ceppi prima dell'inoculazione.
         NOTA: Il volume totale di inoculazione non deve superare i 20 μl per evitare fuoriuscite dalla vagina.
      2. Continuare a tenere sollevata l'estremità posteriore di ciascun topo per 10-20 secondi per evitare che il volume somministrato si accumuli immediatamente all'introito vaginale. Quindi, metti il topo in una nuova gabbia/recipiente o con compagni di gabbia che sono già stati inoculati.
      3. Ripetere il passaggio 2.2. e il passaggio 2.3. per ogni topo. Non rimettere mai i topi in una gabbia con animali che non sono ancora stati inoculati. Ciò impedisce l'esposizione involontaria dei topi a batteri resistenti alla streptomicina prima dell'inoculazione.
   4. Dopo che tutti i topi sono stati inoculati, rimettere il tubo dell'inoculo nella camera anaerobica. Preparare e impiattare un'altra diluizione seriale come descritto al punto 1.5. Questo è il CFU post-inoculazione. Confrontare le CFU delle piastre post-inoculazione e pre-inoculazione per determinare se la vitalità dell'inoculo è diminuita all'esterno della camera anaerobica durante l'inoculazione degli animali.
   5. Placcare le lavande vaginali raccolte al punto 2.2. su agar selettivo (in questo caso, 1 mg/mL di streptomicina). Incubare le piastre per 1-2 giorni in una camera anaerobica a 37 °C ed esaminare la crescita. NOTA: La crescita indica che i membri endogeni del microbioma sono resistenti al marcatore di selezione e possono, quindi, oscurare l'enumerazione delle CFU dell'organismo bersaglio.
7. Raccolta di lavande vaginali per determinare la colonizzazione vitale di Gardnerella
   1. Raccogli i lavaggi vaginali in momenti selezionati per analizzare la colonizzazione vaginale. Raccogli come descritto nel passaggio 2.2.
   2. Subito dopo il prelievo, trasferire le lavande vaginali in una camera anaerobica. Utilizzare 10 μl di ciascun lavaggio per eseguire la diluizione e la placcatura in serie su agar selettivo come descritto al punto 1.5. Utilizzare i conteggi CFU come misura della colonizzazione vaginale da parte di Gardnerella (o di un altro anaerobo di interesse).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
β-estradiolo 17-valerato	Sigma	E 1631	Estrogenizzazione dei topi
1x PBS	Pescatore	MT21040CM	lavanda vaginale, preparazione dell'inoculo di G. vaginlalis , raccolta e omogeneizzazione dei tessuti
Camera anaerobica	Schivo	7200000	Crescita di batteri anaerobi
Bacto agar	Pescatore	DF0140074	Placche di agar per G. vaginalis, F. nucleatum e P. bivia
Glucosio	Sigma	G7528	Terreni NYCIII per la crescita di G. vaginalis
HEPES	Cellgro	25-060-CL	Terreni NYCIII per la crescita di G. vaginalis
Siero per cavalli	Emostatico	SHS500	Terreni NYCIII per la crescita di G. vaginalis
Miscela di idrogeno gassoso (5% idrogeno, 10% CO₂, 85% azoto)	Matheson		Gas per camera anaerobica
Depuratore d'acqua Milli-Q	Millipore	IQ-7000	per la produzione di terreni e l'omogeneizzazione
NaCl	Sigma	S3014	Terreni NYCIII per la crescita di G. vaginalis
Azoto gassoso	Aria gas		Gas per camera anaerobica
Puntali filtranti P-200	Biografia ISC	P-1237-200	lavande vaginali e inoculazioni batteriche
Olio di sesamo	Pescatore	ICN15662191	Estrogenizzazione dei topi
Spettrofotometro	BioChrom	80-3000-45	misurazione del OD₆₀₀ batterico
Streptomicina	Gibco	11860038	Aggiungi ai terreni di agar per realizzare piastre selettive
Estratto di lievito	Pescatore	DF0127-17-9	Terreni NYCIII per la crescita di G. vaginalis