Seedling Flood Assay per lo screening della resistenza batterica nei pomodori

Abstract

Fonte: Hassan, J. A., et al. Identificazione ad alto rendimento della resistenza a Pseudomonas syringae pv. Pomodoro nel pomodoro utilizzando il saggio di inondazione della piantina. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra un metodo per lo screening della resistenza batterica in diversi ceppi di pomodoro utilizzando piantine di dieci giorni inoculate con una sospensione batterica. Spiega come i batteri invadono gli stomi, rilasciano proteine effettrici per sopprimere l'immunità delle piante e come le risposte delle piante differiscono tra ceppi suscettibili e resistenti. Il risultato viene valutato osservando differenze di crescita visibili, con le piante resistenti che rimangono sane e quelle suscettibili che mostrano danni ai tessuti.

Protocollo

1. Metodo di inondazione della piantina di pomodoro

1. Togliete le piastre con le piantine di 10 giorni dalla camera di crescita e mettetele nell'armadio di biosicurezza per preparare le piastre all'allagamento.
2. Rimuovere il nastro chirurgico da due piastre.
3. Imposta un timer per 3 min. Misurare 6 ml dell'inoculo finale di P. syringae pv. pomodoro (Pst) (Pst19 OD₆₀₀ = 0,0075 o PstDC3000 OD₆₀₀ = 0,005) e trasferire 6 ml di inoculo in ogni piastra con le piantine di 10 giorni.
4. Spingi delicatamente le piantine verso il basso nell'inoculo con una punta di pipetta sterile. Avvia il timer.
5. Tieni un piatto in ogni mano. Inclinare la parte anteriore della piastra verso il basso per accumulare l'inoculo e immergere principalmente i cotiledoni e le foglie delle piantine.
6. Agitare da un lato all'altro 5-7 volte e poi inclinare le piastre all'indietro per coprire le radici e l'intera piastra.
7. Inclinare nuovamente le piastre verso il basso per immergere i cotiledoni e le foglie e ripetere l'operazione per un totale di 3 minuti.
8. Versare l'inoculo dalle piastre, appoggiare le piastre su una superficie piana e quindi versare l'inoculo residuo una seconda volta.
9. Riavvolgere le piastre con nastro chirurgico e ripetere i passaggi 1.2-1.8 per le piastre rimanenti.
10. Incubare nuovamente le piastre nella camera di crescita dopo che tutte le piastre sono state allagate.

Fenotipo dopo 7-10 giorni per PstDC3000 o 10-14 giorni per Pst19.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cabina di biosicurezza, classe II tipo A2
MARCA Cuvette di plastica usa e getta, polistirene	VWR Internazionale	47744-642
Stuzzicadenti in legno piatto Chenille Kraft	VWR Internazionale	500029-808
Stoppino bruciatore ad alcool in vetro	Fisher Scientifico	S41898A / No. W-125
Bruciatori ad alcool in vetro	Fisher Scientifico	S41898 / No. BO125
Reagente glicerolo ACS	VWR Internazionale	EMGX0185-5
Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Tergicristalli per attività delicate	Fisher Scientifico	06-666-A
Cloruro di magnesio, grado ACS	VWR Internazionale	97061-356
Solfato di magnesio eptaidrato, grado ACS	VWR Internazionale	97062-130
Provette per microcentrifuga, 1,5 mL
Provette per microcentrifuga, 2,2 mL
Murashige & Skoog, Sali Basali	Laboratori Caisson, Inc.	MSP01-50LT
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipetta 20-200uL	Rainin	L8-200XLS
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipetta 2-20uL	Rainin	L8-20XLS
Piastra di Petri sterile in polistirene 100 mm x 25 mm	VWR Internazionale	89107-632
Piastra di Petri sterile in polistirene 150 mm x 15 mm	Fisher Scientifico	FB08-757-14
Piastra di Petri sterile in polistirene 150x15mm	Fisher Scientifico	08-757-148
Punte LTS 20 μL 960/10 GPS-L10	Rainin	17005091
Punte LTS 250 μL 960/10 GPS-L250	Rainin	17005093