Consegna localizzata di batteri nel lume intestinale di una larva di pesce zebra mediante microiniezione

Abstract

Fonte: Li, J. et al. Sviluppo di un modello di infezione larvale di pesce zebra per Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la somministrazione basata su microiniezione di Clostridioides difficile marcato in fluorescenza nel lume intestinale di una larva di pesce zebra anestetizzato. Delinea le fasi coinvolte nella preparazione larvale, nell'iniezione batterica e nella conferma della localizzazione batterica all'interno dell'intestino basata sulla microscopia a fluorescenza.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezione di Clostridioides difficile colorato nelle larve di pesce zebra

1. Anestetizzare 20-30 larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione (qui indicato come 5 dpf) con tricaina allo 0,02%-0,04% (la polvere di tricaina viene disciolta in acqua distillata doppia e regolata a pH = 7 con una soluzione di Tris-HCL 1 M) nel terreno di Danieau al 30% ~ 10 minuti prima dell'iniezione. Trasferire le larve anestetizzate in una capsula di Petri fresca da 10 cm e rimuovere l'eccesso del 30% di terreno di Danieau.
2. Metti una goccia di agarosio a basso punto di fusione allo 0,8% sulle larve di pesce zebra per coprire. Regolare delicatamente le larve in posizione laterale. Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio per 30-60 secondi per consentire all'agarosio a basso punto di fusione di solidificarsi. Aggiungere il 30% di terreno di Danieau contenente lo 0,02%-0,04% di tricaina per coprire l'agarosio.
3. Preparare la soluzione iniettabile. Aggiungere 1 μl di rosso fenolo allo 0,5% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in 9 μl dell'inoculo di Clostridioides difficile colorato con colorante per visualizzare il processo di iniezione.
4. Caricare un ago per microiniezione calibrato con la soluzione iniettabile utilizzando un microcaricatore. Montare l'ago caricato su un micromanipolatore e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio.
5. Regolare la pressione di iniezione tra 600 e 900 hPa. Impostare il tempo di iniezione su 0,1–0,3 s per ottenere 0,5–1,0 nL. Posizionare l'ago nel micromanipolatore con un angolo di ~45° rivolto verso le larve incorporate.
6. Posizionare la punta dell'ago sopra il tratto gastrointestinale, vicino al poro urogenitale. Forare attraverso l'agarosio, quindi il muscolo con la punta dell'ago, quindi inserirlo nel lume intestinale e iniettare 0,5-1,0 nL di Clostridioides difficile. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per monitorare le larve iniettate e prelevare le larve iniettate correttamente per l'imaging confocale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarosio bassofondente (LM)	Pronadisa	8050	Viene utilizzato nelle piastre di agarosio
BacLight Macchia batterica rossa	Thermo Fisher Scientifico	B35001	Colorante fluorescente
Vetro capillare	Apparato di Harvard	30-0019	Aghi per iniezione
Clostridioides difficile			R20291, ceppo ribotipo 027, produzione TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	Visualizzazione del materiale A994
FIGI	Piattaforma open source		Elaborazione di immagini
Micro iniettore	Eppendorf	5253000017
Microscopio confocale Leica SP8	Leica
Rosso fenolo	Sigma-Aldrich	P0290
Tricaina	Sigma-Aldrich	E10521