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Dissezione dell'intestino larvale di pesce zebra per recuperare Clostridioides difficile vitale
- Isolare i tratti gastrointestinali dalle larve per analizzare la carica batterica. Inizia con l'eutanasia delle larve di pesce zebra con lo 0,4% di tricaina.
- Sciacquare brevemente il pesce zebra con 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) sterile e trasferirlo su una piastra di agarosio fresca.
- Dissezione del pesce zebra
- Inserire un ago nel tronco dorsale delle larve di pesce zebra vicino alla testa per immobilizzare il pesce zebra. Rimuovere la testa dietro le branchie con una lancetta.
- Inserire il secondo ago al centro del tronco dorsale. Inserisci il terzo ago nell'addome del pesce zebra ed estrai l'intestino dalla cavità del corpo.
NOTA: È necessaria estrema cura per isolare l'intestino intatto. Se è difficile farlo, eseguire ulteriori tiri per separare il resto dell'intestino dagli organi interni rimanenti. - Utilizzare un ago per microiniezione per trasferire 10-15 intestini in una provetta da 1,5 ml contenente 200 μl di PBS sterile.
- Omogeneizzare l'intestino con un pestello per rompere il tessuto e preparare gli omogeneizzati. Assicurati che il pestello raggiunga il fondo del tubo per distruggere completamente tutto l'intestino.
- Incubare gli omogeneizzati in un terreno di allevamento di C. difficile contenente D-cicloserina e cefoxitina, con o senza taurocolato (TCA, un germinante delle spore di C. difficile ) in una camera anaerobica.
- Incubare la piastra in modo anaerobico per 48 ore a 37 °C.